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    重組漢坦病毒核殼蛋白抗原診斷腎綜合征出血熱



    錄入時(shí)間:2011-3-1 9:28:17 來(lái)源:中華檢驗醫學(xué)網(wǎng)

    【摘要】目的 證實(shí)重組漢坦病毒核殼蛋白(rNP)對腎綜合征出血熱的診斷價(jià)值。方法 用大腸埃希菌表達漢坦病毒76118株S基因獲得rNP,從該病毒感染細胞裂解液獲得天然NP。在相同的捕捉法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)系統中,比較研究rNP與天然NP的抗原功能。用rNP抗原的捕捉法ELISA檢測臨床血清,與間接免疫熒光(IFA)檢測特異性IgG的結果相比較。結果 用rNP和天然NP平行檢測116份各類(lèi)血清,兩者符合率達99.21%; 用rNP的捕捉法ELISA檢測610份臨床血清,結果與IFA的符合率為93.61%。結論 rNP抗原的捕捉法ELISA對腎綜合征出血熱具有診斷價(jià)值。
     
    Recombinant nucleocapsid protein of Hantavirus for detecting hemorrhagic fever with renal syndrome
     
    TIAN Junxi, WANG Jingjun, ZHOU Yanping, et al.
      Shanxi Provincial Station of Sanitation and Anti-epidemic, Xi′an 710054, China
     
       【Abstract】Objective To use recombinant nucleocapsid protein (rNP) of Hantavirus as antigen in IgM-antibody-capture ELISA (MacELISA) to detect the specific IgM in hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS).Methods rNP was obtained from the small (S) genome segment of Hantavirus strain 76118 in Escherichia coli cells and natural NP from the lysis of cultural cell infected by same virus. The antigen effect of rNP was compared with that of natural NP in a same system of MacELISA. The results of clinical sera detected by MacELISA of rNP antigen was compared to those of specific IgG detected by indirect fluoresecent assay (IFA).Results 116 sera from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), rheumatoid, encephalitis B were detected with antigen of rNP and natural NP in MacELISA respectivelyce. Their concidence rate was 99.21%. 610 sera of suspected HFRS were tested by MacELISA of rNP antigen with a coincident rate of 93.61% for IFA. Conclusion rNP as antigen in MacELISA is valuable for the diagnosis of HRFS.
     
       【Key words】Hanta virus; Nucleo proteins;Immunoglobulins; Hemorrhagic fever with renal syndrome
     
      腎綜合征出血熱(HFRS)是由漢坦病毒引起的急性傳染病,其實(shí)驗室診斷方法主要有IgM捕捉法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和間接免疫熒光測定(IFA)等技術(shù)[1],所用抗原多來(lái)自病毒感染的乳鼠腦懸液或培養細胞裂解液。我們將基因表達的重組該病毒核殼蛋白(rNP)用于捕捉法ELISA,檢測可疑HFRS患者,它有使用安全、抗原穩定、效價(jià)高等優(yōu)點(diǎn),靈敏性和特異性也較好,現報告如下。
     
      材料和方法
     
      一、材料
     
      1.毒株和基因:漢坦病毒76118株為本站凍存;含該病毒S基因全片段的pGS質(zhì)粒為Schmaljohn[2]構建。
     
      2.抗體:抗人μ鏈抗體為Sigma產(chǎn)品。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記抗漢坦病毒核殼蛋白(NP)單克隆抗體由蘭州生物制品研究所和第四軍醫大學(xué)提供。
     
      3.血清:HFRS患者血清49份樣本為我站1993~1999年收集;45份健康人血清來(lái)自行業(yè)體檢者;10份類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性血清由陜西省人民醫院提供;12份乙腦患者血清為我站收集。
     
      4.臨床可疑HFRS患者血清,共610份,為省內各醫院送檢的標本。
     
      二、方法
     
      1.rNP的制備:用聚合酶鏈反應從pGS中擴增出漢坦病毒S基因全編碼區H1.3S并克隆入pUC18,經(jīng)鑒定和培養擴大后,亞克隆入pBV220。將該表達質(zhì)粒轉化大腸埃希菌DH5α,32℃培養至對數晚期,42℃誘生8 h。表達菌液離心收菌體,用50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TrisHCl, pH8.0)、100 mmol/L氯化鈉洗滌后重懸,超聲破菌,加0.5%辛基酚聚乙二醇醚(TritonX-100)作用10 min后,離心、沉淀,再離心,沉淀用8 mol/L脲溶解數小時(shí),最后對磷酸鹽緩沖液(PBS)復性。
     
      2.感染細胞裂解液制備:漢坦病毒76118株感染Vero-E6細胞[1],IFA檢測病毒強陽(yáng)性時(shí),將細胞凍融3次,離心收集裂解液。
     
      3.捕捉法ELISA:抗人μ鏈抗體用1 mg/L包板,加10 mmol/L PBS(pH7.6)稀釋的待檢血清100μl/孔,37℃ 30 min后,用含0.05%吐溫-20的10 mmol/L TrisHCL( pH7.4)洗板,加100 μl/孔的rNP(10 mg/L,溶于10 mmol/L pH7.6的PBS,含0.02%吐溫-20和5 mg/L的牛血清白蛋白)或感染細胞裂解液(1∶2稀釋?zhuān)?7℃ 60 min,再加HRP-抗漢坦病毒NP單抗100 μl/孔,37℃ 60 min,用四氨基聯(lián)苯氨-過(guò)氧化氫顯色10 min,2 mol/L硫酸終止反應,在450 nm讀吸光度值(A)。其結果≥2.1×陰性標本平均值,判定為陽(yáng)性,否則陰性。
     
      4.IFA檢測:用76118株感染Vero細胞制作抗原片,操作按文獻[1]進(jìn)行。
     
      結果
     
      1.rNP與天然NP的比較試驗:分別用rNP和感染細胞裂解液為抗原,在相同的捕捉法ELISA系統中,平行檢測HFRS患者、健康人和類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性及乙腦患者血清。檢測49份HFRS患者血清的陽(yáng)性率分別為91.84%和89.80%、符合率為97.96%,健康人及其他患者血清都為陰性,符合率100%。
     
      2.靈敏性試驗:45份IgM抗體陽(yáng)性血清,用rNP重組核殼蛋白的捕捉法ELISA測定其最大可稀釋度,結果平均幾何滴度為5 120。
     
      3.臨床血清檢測:用重組核蛋白(rNP)的捕捉法ELISA檢測610份疑似HFRS患者的血清,與IFA檢測特異性IgG相比較,結果ELISA陽(yáng)性率60.00%,IFA陽(yáng)性率61.15%,兩種方法總符合率為93.61%,其中陽(yáng)性符合率94.10%,陰性符合率92.83%,經(jīng)配對χ2檢驗分析,兩種方法差異無(wú)顯著(zhù)意義(χ2=0.23 ,P>0.05)。
     
      討論
     
      早期診斷對HFRS的治療和降低病死率極為重要[1]。運用基因工程技術(shù)制備活性好、效價(jià)高、穩定、安全的抗原,有助于HFRS診斷技術(shù)的應用和推廣。NP是漢坦病毒的主要結構蛋白,對病毒的免疫有重要作用,在感染時(shí)機體會(huì )產(chǎn)生大量的針對性抗體,被公認對病毒感染的診斷有應用價(jià)值[2,3]。對編碼NP的S基因片段進(jìn)行克隆、測序、真核及原核表達的研究,以及證明重組NP與天然NP在抗原性上無(wú)明顯的差異,為rNP在診斷中的應用奠定了基礎。國內有將原核表達的rNP用于間接法ELISA,檢測患者特異性IgG[4]和IgM[5]抗體的報道,國外也有相類(lèi)似的研究[6]。
     
      我們先用大腸埃希菌表達了漢坦病毒76118株的S基因,將其產(chǎn)物rNP作為抗原用于捕捉法ELISA方法。分別以rNP和感染細胞裂解液(含天然NP)為抗原,在相同的捕捉法ELISA系統中平行檢測了各類(lèi)血清樣品,結果兩者符合率為99.12%,真陰性率100%,真陽(yáng)性率分別為91.84%和89.80%,證實(shí)rNP與天然NP在捕捉法ELISA中具有相同的功能。再用rNP的捕捉法ELISA檢測610份臨床疑似HFRS血清的特異性IgM,其結果與IFA檢測特異性IgG比較,總符合率是93.61%,其中陽(yáng)性符合率94.10%,陰性符合率92.83%,經(jīng)配對χ2檢驗,差異無(wú)顯著(zhù)意義。由于IFA用的是全病毒抗原,所以說(shuō)明rNP在診斷應用中有與全病毒基本一致的功能,更加證實(shí)了該rNP用于捕捉法ELISA對HFRS的診斷價(jià)值。
     
      
    作者:田君喜 王敬軍 周燕平
    參考文獻
      1 宋干,汪誠信,姜克儉,等.流行性出血熱防治手冊.人民衛生出版社,1987.193-208.
      2 Schmaljohn CS,Jennigs GB, hay J, et al. Coding strategy of the small genome segment of Hantaan virus. Virology, 1986,155:633-643.
      3 Schmaljohn CS, Sugiyama K, Schmaljohn AL, et al. Baculovirus expression of the small genome segment of hantaan virus and potential use of the expressed nucleocapsid protein as a diagnostic antigen. J Gen Virol, 1988, 69:777-786.
      4 梁米芳,李德新,杭長(cháng)壽,等.漢坦病毒S基因在大腸桿菌中的表達和及其初步應用.中華實(shí)驗和臨床病毒學(xué)雜志,1993,7:225-229.
      5 黃長(cháng)形,李盈盈,楊為松,等.腎綜合征出血熱病毒核蛋白在大腸桿菌中表達及產(chǎn)物的初步應用.中華傳染病學(xué)雜志,1996,14:28-31.
      6 Wang M , Rossi C, Schmaljohn CS, et al. Expression of non-conserved regions of the S genome segments of three hantavirus: evaluation of the expressed polypeptides for diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome. J Gen Virol, 1993,74: 1115-1124.
     

     

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