重組體的篩選

  目的基因和載體重組并進(jìn)入宿主細胞后，由于操作失誤及不可預測因素的干擾等，并不能全部按照預先設計的方式重組和表達，真正獲得目的基因并能有效表達的克隆子只是其中的一小部分，絕大部分仍是原來(lái)的受體細胞，或者是不含目的基因的克隆子。為了從處理后的大量受體細胞中分離出真正的克隆子，目前已建立起一系列的篩選和鑒定方法。

  重組體篩選的方法很多，歸納起來(lái)可分為兩種：在核酸水平或蛋白質(zhì)水平上篩選。從核酸水平篩選克隆子可以通過(guò)核酸雜交的方法。這類(lèi)方法根據DNA-DNA、DNA-RNA堿基配對的原理，以使用基因探針技術(shù)為核心，發(fā)展了原位雜交、Southen雜交、Northen 雜交等方法。從蛋白質(zhì)水平上篩選克隆子的方法主要有：檢測抗生素抗性及營(yíng)養缺陷型、觀(guān)測噬菌斑的形成、檢測目標酶的活性、目標蛋白的免疫特性和生物活性等。

  無(wú)論采用哪一種篩選方法，最終目的都是要證實(shí)基因是否按照人們所要求的順序和方式正常存在于宿主細胞中。

  利用抗生素抗性基因篩選

  這是一種最早發(fā)展而且目前仍廣泛使用的方法。在DNA重組載體設計時(shí)已經(jīng)在質(zhì)粒中裝配了抗生素抗性基因標記，如四環(huán)素抗性基因（Tetr）、氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）等。當編碼有這些抗藥性基因的質(zhì)粒攜帶目的基因進(jìn)入宿主細胞后，細胞就具有了相應的抗生素抗性，如果在篩選平板的培養基中加入有關(guān)抗生素，只有含質(zhì)粒的細胞才能生長(cháng)。這種方法只能證明細胞中確實(shí)已經(jīng)有質(zhì)粒存在，但無(wú)法保證質(zhì)粒中已經(jīng)攜帶了目的基因。為了防止誤檢，人們進(jìn)一步發(fā)展了采用插入缺失的方法，同一質(zhì)粒中往往有兩種抗藥性基因，在體外重組時(shí)故意將目的DNA插入到其中一個(gè)抗性基因中，使其失活，這樣得到的宿主細胞便可在含另一抗生素的培養基中存活，但在兩種抗生素都加入的平板上則不能生長(cháng)。將這種菌株篩選出來(lái)，就能保證細胞中的重組質(zhì)粒確實(shí)已經(jīng)插入了目的基因。由于需要兩次篩選，操作比較麻煩。

  例如pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗生素抗性基因，抗氨芐青霉素基因（Ampr）上有單一的PstI位點(diǎn)，抗四環(huán)素基因（Tetr）上有SalI和BamHI位點(diǎn)。當外源DNA片段插入到SalI/BamHI位點(diǎn)時(shí)，使抗四環(huán)素基因失活，這時(shí)含有重組體的菌株從AmprTetr變?yōu)锳mprTet8。這樣，凡是在A(yíng)mpr平板上生長(cháng)而在A(yíng)mprTetr平板上不能生長(cháng)的菌落就可能是所要的重組體。

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