簡(jiǎn)化的兩步法細菌內同源重組腺病毒表達載體重組高效制備p53基因

【摘要】  目的  應用細菌內同源重組高效制備p53基因重組腺病毒。方法  設計引物擴增p53基因，在上下游引物分別引入Xhol和HindⅢ酶切位點(diǎn)，將p53基因亞克隆連接到經(jīng)相同酶切的p shuttle-cmv轉移質(zhì)粒上，轉化DH5α篩選卡那霉素抗性菌落構建重組腺病毒轉移質(zhì)粒p shuttle-cmv-p53用Pmel酶切線(xiàn)性化采用兩步法進(jìn)行同源重組：先將腺病毒骨架質(zhì)料pAdEasy-1轉化氯化鈣法制備的BJ5183感受態(tài)細菌，篩選得到鏈霉素和氨芐青霉素抗性的AdBJ5183轉化菌；再將線(xiàn)性化的p shuttle-cmv-p53轉化氯化鈣法制備的AdBJ5183感受態(tài)細菌，在細菌內進(jìn)行同源重組，挑選卡那霉素抗性菌落培養并提取質(zhì)粒，瓊脂糖電泳挑選大片斷的重組質(zhì)粒pAdBJ5183-P53分別用限制性?xún)惹忻窹acI和BstXI及PCR法鑒定。結果  成功構建了p53基因重組腺病毒表達載體。結論  采用簡(jiǎn)化的兩步氯化鈣化學(xué)轉化法可以取代電穿孔法高效構建重組腺病毒表達載體。

   

    【關(guān)鍵詞】  腺病毒載體；同源重組；p53基因

   

    Construction of recombinant adenoviral vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination in bacteria

   

    ZOU Chang-yong，QUANG Jia-wu，TIAN Sheng-he，et al.Wuhan Institute of Biological Products，Wuhan 430060，China

   

    【Abstract】  Objective  To construct recombinant replication-defective human adenovirus serotype 5 vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination protocol in bacteria.Methods  wt-p53 gene was firstly subcloned into a transfer vector p shuttle-cmv and the positive recombinant p shuttle-p53 was linearized by PmeI.Then the simplified two-step homologous recombination protocol was employed for the construction of recombinant adenoviral vector.In step one，adenoviral skeletal plasmid pAdeasy-1 was transformed into BJ5183 competent cells by calcium chloride chemical methed to obtain pAdBJ5183;and in step two，linearized psh-p53 plasmid was transformed into pAdBJ5183.The possible positive adenoviral plasmids were selected by agarose gel electrophoresis and indentified by PacI as well as BxtXI cleaved pattern.Results  Replication-defective recombinatant adenovirus containing human p53 gene was successfully constructed.Conclusion  The results indicated that the calcium chloride chemically simplified two-step homologous recombination protocol can replace the co-transformation by electroperforation and may have broaed utility in system that involve homologous recombination in bacteria.

   

    【Key words】  adenoviral vector;homologous reombination;p53 gene

   

    復制缺陷型腺病毒可以高效介導基因的體內外轉移；感染細胞范圍廣，不但可以感染分裂期細胞，也可感染靜止期細胞；感染細胞時(shí)其DNA不整合到宿主細胞染色體中，安全可靠。因此成為基因治療中常用的載體。重組腺病毒載體的構建方法有真核細胞內質(zhì)粒重組法、酵母人工染色體克隆系統、Cre/loxp定點(diǎn)重組系統、末端蛋白-DNA復合物共轉染法等［１～３］。以上方法牽涉到的步驟和環(huán)節較多、工作量大、實(shí)驗周期長(cháng)。1998年He等［4］建立了細菌內質(zhì)粒共轉化同源重組方法，該法簡(jiǎn)便快速、實(shí)驗周期短，但是共轉化需要電穿孔儀，且同源重組成功率不到20%。筆者在實(shí)際工作中對該法進(jìn)行了改進(jìn)，采用簡(jiǎn)化的兩步氯化鈣化學(xué)轉化法代替電穿孔共轉化法構建了p53重組腺病毒表達載體。

   

    1  材料與方法

   

    1.1  實(shí)驗材料  pAdEasy-1、pshuttle-cmv質(zhì)粒，BJ5183、

   

    DH5α大腸桿菌，PmeI酶購自Qbiogene公司；攜帶p53基因的質(zhì)粒由馬延高教授惠贈；PacI酶購自New England公司；PCR Premix、DL2000Marker購自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker購自Promega公司；其他分子生物學(xué)工具酶購自MBI公司。

   

    1.2  重組轉移質(zhì)粒的構建  設計擴增p53基因的上下游引物分別為：

   

    p53-up:5 atg tct cga gat gga gga gcc gca gtc aga 3 （30bp），

   

    p53-down:5 aag taa gct ttc agt ctg agt cag gcc ctt 3 （30bp），在上下游引物分別引入XhoI和HindⅢ酶切位點(diǎn)，由上海生工合成。采用上述引物以攜帶p53基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增p53基因片斷。PCR參數為：94℃變性5min;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳回收，連接到同樣經(jīng)XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv轉移質(zhì)粒中；轉化DH5α感受態(tài)菌，卡那霉素抗性平板篩選。

   

    1.3  重組轉移質(zhì)粒的鑒定  挑選卡那霉素抗性平板篩選菌落培養，堿裂解法提取質(zhì)粒，用XhoI和HindⅢ酶切鑒定，并以能酶切出與目的基因片段大小相符的質(zhì)粒為模板，用上述引物進(jìn)行PCR鑒定。得到的重組轉移質(zhì)粒命名為psh-p53。再用上述引物由上海生工公司測定psh-p53中目的基因片段序列。

   

    1.4  兩步法細菌內同源重組產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒

   

    1.4.1  step1:用氯化鈣法制備BJ5183感受態(tài)細菌  將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉化BJ5183感受態(tài)細菌，接種在鏈霉素和氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取菌落培養并抽提質(zhì)粒，以pAdEasy-1為對照，用BstXI酶切鑒定，得到的陽(yáng)性菌命名為AdBJ5183菌。

   

    1.4.2  step2:同源重組  用氯化鈣制備AdBJ5183感受態(tài)細菌；將序列正確的重組轉移質(zhì)粒psh-p53用PmeI酶切線(xiàn)性化，不需滅活PmeI酶，也不需回收，直接取大約30ng酶切線(xiàn)性化質(zhì)粒轉化AdBJ5183感受態(tài)細菌，卡那霉素抗性平板篩選，挑取菌落培養并抽提質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖電泳初篩分子量大于30kbp的質(zhì)粒，以pAdEasy-1為對照，分別用PacI、BstXI酶切鑒定，對酶切圖譜符合的質(zhì)粒采用前述擴增目的的基因片段的引物進(jìn)行PCR鑒定。得到的陽(yáng)性菌命名為AdBJ5183-p53菌。相應的陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒為pAdBJ5183-p53。再將AdBJ5183P53轉化DH5α得到pAdp53。

   

    2  結果

   

    2.1  重組轉移質(zhì)粒psh-P53的構建及鑒定

   

    （1）重組轉移質(zhì)粒psh-P53經(jīng)XhoI和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察，出現一條約7.4kg的轉移質(zhì)粒帶和一條約1.2kb的p53目的基因帶，見(jiàn)圖1。

   

    （2）以能酶切出與目的基因片段大小相符的質(zhì)粒為模板，用擴增目的基因的引物進(jìn)行PCR鑒定�？梢缘玫郊s1.2kb大小的片斷，見(jiàn)圖2。

 

圖1  重組轉移質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig1  screening recombinant transfer vecter by XhoI and HindⅢ   lanel:DL2000Marker lane2～4：recombinant transfer vecter/XhoI and HindⅢ lane5～6：transfer vector/XhoI and HindⅢ as control

 

圖2  重組轉移質(zhì)粒的PCR鑒定

Fiv2  screening recombinant transfer vecter by PCR lane1:negative control    lane2:positive control lane3:recombinant transfer vecter lane4:DL2000 marker

 

    （3）測序結果經(jīng)Vector NTI軟件分析正確。

    

    2.2  重組腺病毒表達質(zhì)粒的構建及鑒定

   

    （1）將腺病毒骨架質(zhì)粒轉化BJ5183感受態(tài)菌，抽提鏈霉素和氨芐青霉素雙抗性的質(zhì)粒，對照骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，用BstXI酶切鑒定。pAdEasy-1質(zhì)粒有6個(gè)BstXI酶切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生6個(gè)片斷。電泳結果顯示，AdBJ5183質(zhì)粒與pAdEasy-1圖譜一致，見(jiàn)圖3。

 

圖3  pAdBJ5183質(zhì)粒用BstXI酶切鑒定

padBJ5183 plasmids cleaved pattern by BstXI lane1:λDNA/HindⅢ Marker，lane2:pAdEasy-1，lane3:pAdEasy-1/BstXI，lane4:pAdBJ5183/BstXI

 

    （2）線(xiàn)性化的重組轉移質(zhì)粒psh-p53轉化AdBJ5183感受態(tài)細菌進(jìn)行同源重組后，抽提卡那霉素抗性的質(zhì)粒，0.8%脂糖電泳發(fā)現有2種質(zhì)粒：其一分子量約34kb，為可能的重組腺病毒質(zhì)粒；另一分子量約9kb，為重組轉移質(zhì)粒psh-p53�？梢院苤庇^(guān)方便地初篩出可能的大片斷重組腺病毒質(zhì)粒（圖略）。

       

    PacI酶切分子量約34kb的質(zhì)�？沙霈F一條約30～35kb的大片斷和一條4.5kb的特征性片斷見(jiàn)圖4。與預期結果相符。

   

    BstXI酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒 PAdEasy-1質(zhì)粒有6個(gè)BstXI酶切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生6個(gè)片斷，依次為11921bp、8237bp、5251bp、4254bp、2379bp、1399bp。其與線(xiàn)性化的psh-p53在BJ5183中發(fā)生同源重組的位置只引起片斷2的改變。本實(shí)驗采用Pshuttle-cmv為轉移質(zhì)粒，同源重組后片斷2將漂移至11～12kb左右，與片斷1重疊，只可以觀(guān)察到5條帶。與預期結果相符。結果見(jiàn)圖5。

 

圖4  重組腺病毒質(zhì)粒PAdBJ5183 p53用pacI酶切鑒定

Fig4:Identification of recombinant Adenoviral plasmids by PacI lane1:λDNA/HindⅢ　Marker，lane2:PAdeasy-1/PacI，lane3-6:pAdBJ5183-p53/PacI

 

圖5重組腺病毒質(zhì)粒PAdBJ5183 p53用BstXI酶切鑒定

Fig5  Identification of recombinant Adenoviral plasmids by BstXI cleaven patten

lane1:λDNA/HindⅢ Marker，lane2～4：pAdBJ5183-p53/BstXI；

lane5:PAdeasy-1/BstXI；lane:PAdeasy-1

 

    以酶切鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，可擴增出與目的基因大小相符合的片斷，見(jiàn)圖6。

 

圖6  重組腺病毒質(zhì)粒的PCR鑒定

Fig6  PCR amplified p53 gene of recombinant Adeneviral plasmids lane1:DL2000 marker；lane2-6:pAdBJ5183;lane7:psh-p53 positive control;lane8:negative control

 

    3  討論

   

    傳統的構建重組腺病毒的方法是在293細胞內進(jìn)行質(zhì)粒間同源重組，這些方法存在細胞類(lèi)同源重組效率低、實(shí)驗周期長(cháng)等缺點(diǎn)，給研究工作帶來(lái)了諸多不便；利用生長(cháng)周期快、操作方便的大腸桿菌實(shí)現質(zhì)粒間同源重組產(chǎn)生腺病毒的方法具有重組效率高、病毒基因組高度一致、不需蝕斑純

   

    化篩選純系病毒等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行細菌內同源重組時(shí)，最初的方法是將腺病毒骨架質(zhì)粒和線(xiàn)性化的重組轉移質(zhì)粒電穿孔共轉化大腸桿菌BJ5183，這種方法需要電穿孔儀，而且重組效率相對較低；Zeng等［5］采用兩步法進(jìn)行了改進(jìn)，先用電穿孔法將骨架質(zhì)粒PAdEasy-1轉化電穿孔感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，得到BJ5183AdEasy，再將線(xiàn)性化的重組轉移質(zhì)粒電穿孔法轉化電穿孔感受態(tài)大腸桿菌BJ5183AdEasy進(jìn)行同源重組，由于該法是將轉移質(zhì)粒轉化到已攜帶有骨架質(zhì)粒的繁殖能力強的BJ5183菌中，避免了將轉移質(zhì)粒轉化到有缺陷或復制能力弱的細菌中，因而成功率提高到94%（16/17），但該法仍然需要電穿孔儀，一般實(shí)驗室難以推廣。筆者將該兩步法的電穿孔部分改為傳統的氯化鈣化學(xué)轉化法，而且線(xiàn)性化的重組轉移質(zhì)粒不需經(jīng)過(guò)熱滅活PmeI酶及凝膠電泳回收，直接用于轉化，也得到了較高的重組率（6/8）。本研究正在進(jìn)行p53基因重組腺病毒生物學(xué)特性的研究及對腫瘤細胞作用的研究。

作者：鄒昌勇，全家嫵，田生和，楊京生，吳季南  中華醫藥雜志 

作者單位： 430060 湖北武漢，武漢生物制品研究所

【參考文獻】

 

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5  Zeng M，Smith SK，Siegel F，et al.AdEasy system made easier by selecting the viral backbone plasmid preceding homologous recombinanation.Bio Techniques，2001，13（2）:260-262.