重組腺病毒構建、擴增及純化基本技術(shù)操作

一 目的基因的克�。ㄒ�pshuttle-CMV質(zhì)粒為例）

1.      選擇適當酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切連接，將目的片段插入pshuttl-CMV質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)。

2.      重組質(zhì)粒鑒定： 酶切鑒定或測序。

3.      重組質(zhì)粒擴增，純化并準備適量含目的基因的穿梭質(zhì)粒。

4.      用PmeI單酶切線(xiàn)性化重組穿梭質(zhì)粒，電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開(kāi)。

5.      膠回收線(xiàn)性化質(zhì)粒，以備共轉化使用。

二 共轉化

1  大腸桿菌BJ5183電轉感受態(tài)制備

從新鮮瓊脂板上挑取單個(gè)BJ5183細菌，接種于LB培養基中，37℃振搖過(guò)夜。

接種25ml過(guò)夜培養物于500ml LB培養基，37℃振搖，至OD600 達到0.4。

迅速將培養物置于冰浴中30min，至充分冷卻。

將菌液轉移至預冷的離心管中，4℃下以2500r/min離心15 min，棄培養液，回收細胞。

以10ml預冷的10%甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。

 加約1ml（適量）預冷的10%甘油重懸沉淀，稀釋?xiě)乙?/SPAN>100倍，測量OD600，至稀釋濃度為2-3×1010個(gè)細胞/ ml (1.0 OD600約2.5×1010個(gè)細胞/ml)。分裝，-80℃或液氮保存待用。

2  病毒骨架質(zhì)粒轉化大腸桿菌，擴增，純化。

3  將1-5µl (約1µg) 線(xiàn)性化的穿梭質(zhì)粒及1µl（約100ng/µl）病毒骨架質(zhì)粒（如pAdEasy-1）加入至含約40µl BJ5183電轉感受態(tài)的EP管中混勻,冰上冷卻。

4  將混合物加入電轉杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms）。

5  電擊結束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養液，37℃低速振蕩40min。

6  取適當體積的電擊轉化細胞液涂于數個(gè)卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培養16-20hr。

7  次日挑取平板上長(cháng)出的菌落（選擇最小的菌落）,接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養基，37℃培養10-15hr。

8  堿裂法提取質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質(zhì)粒為可能陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步酶切鑒定。以PacI單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb）,及一條小片段（約3.0或4.5kb）（同時(shí)可進(jìn)行其它酶切鑒定），則基本確定為陽(yáng)性克隆。

9  取1-5µl 陽(yáng)性質(zhì)粒轉化至DH5α大腸桿菌細胞（BJ5183為recA+,質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變，DH5α或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩定擴增已鑒定的重組質(zhì)粒），擴增細菌并純化質(zhì)粒。

三 重組病毒質(zhì)粒轉導293細胞

1  293細胞培養：轉導24小時(shí)前，以方瓶為例，接種2×106  293細胞于25cm2方瓶，使生長(cháng)密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）

2  以PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒（轉導25cm2方瓶約需4µgDNA），完全線(xiàn)性化后，乙醇沉淀，再以20 µl ddH2O溶解。

3  脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒（以Lipofectamine為例）:每4µg PacI約需20µl Lipofectamine包裹.質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于500µl無(wú)血清培養基再混合,置于室溫下15-30min。

4  以無(wú)血清培養基輕輕洗滌培養瓶，另加2.5ml無(wú)血清培養基，37℃放置10min。

5  將Lipofectamine-DNA混合物加入培養瓶，37℃孵箱放置4hr。

6  4hr后，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養基（含10% FCS）。如有大量細胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養基，37℃孵育過(guò)夜，再換液。

7  培養過(guò)程中觀(guān)察細胞生長(cháng)情況。約2周后可觀(guān)察到細胞病變（CPE）出現（如用pAdTrack-CMV質(zhì)粒，由于含GFP，可觀(guān)察到綠色熒光）。

四 重組病毒鑒定

1  轉導10-14d后，收集細胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細胞，離心后收集上清保存于-80℃。

2  取30-50% 步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細胞。2-3d后出現明顯細胞病變。

3  感染后3-5d,當1/3-1/2細胞漂浮時(shí)收集病毒。按步驟1收集細胞并準備病毒上清。通過(guò)Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。

4  PCR鑒定重組病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，離心后取1-2µl作PCR。

五 重組病毒擴增，純化

1  75cm2方瓶中接種293細胞，至密度達到90%，加入適量病毒上清感染細胞。3-4d后，細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮，則收集所有細胞。約500g轉速離心，棄上清。

2  以滅菌PBS重懸沉淀，反復凍融4次。4℃下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm2方瓶細胞。

3  CsCl連續梯度離心純化：50ml離心管中稱(chēng)量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混勻，體積約為10ml。轉移至12ml超速離心管（用于SW41轉頭）中，覆蓋約2ml礦物油。平衡后，10℃下32000 rpm離心18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶。

（也可CsCl不連續梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至體積達到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm離心90min (SW28轉頭)，用注射器抽吸下層藍白色病毒帶）

4  病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose），滅菌處理。4℃透析，更換3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

六 病毒滴度測定（TCID50）

1  細胞準備:96孔板中接種100µl 293細胞,每孔細胞數約104個(gè),以2% DMEM培養

2  稀釋病毒液準備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個(gè)較高濃度（如10-3-10-10），每個(gè)濃度重復10個(gè)，每孔加入病毒稀釋液100µl。另留兩排不加病毒液作為陰性對照。37℃下，孵箱培養10天。

3  10d后觀(guān)察細胞，記數每排出現CPE的孔數，計算細胞病變率。（如某一濃度各孔細胞全部病變，比率為1，如無(wú)細胞病變，則比率為0）。

4  計算T =10×101 + d (S - 0.5) /ml

d = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋℃，d=1）

   S = 各濃℃細胞病變比率之和

實(shí)驗室重組腺病毒常用質(zhì)粒：病毒骨架質(zhì)粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭質(zhì)粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV

上一篇：植物病毒病檢測方法（一）

下一篇：植物病毒病檢測方法（二）