利用重組分支桿菌噬菌體快速篩選耐利福平結核分支桿菌

　　關(guān)鍵詞：分支桿菌噬菌體；利福平；藥敏試驗；分支桿菌，結核

　　近年的監測發(fā)現結核病的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內均有上升的趨勢，同時(shí)耐藥菌株的感染增加，給結核病的防治帶來(lái)了很大的困難。利福平(R)是最常用的一線(xiàn)抗結核藥，研究表明對利福平耐藥的分支桿菌常常對其它抗結核藥耐藥。由于常規結核分支桿菌檢測和藥物敏感試驗方法需6～12周，無(wú)法給臨床提供及時(shí)、準確的用藥參考，因此如何縮短藥物敏感試驗時(shí)間、提高檢測的敏感性和特異性，已引起國內外學(xué)者關(guān)注。我們采用兩株重組的可表達熒光素酶結核分支桿菌噬菌體，建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的結核分支桿菌利福平藥敏試驗方法。

　　材料與方法

　　一、材料

　　卡介苗（BCG）購自衛生部上海生物制品研究所。結核分支桿菌H₃₇Ra（ATCC25177）和結核分支桿菌H₃₇Rv（ATCC36801）購自中國藥品生物制品檢定所。恥垢分支桿菌(M.smegmatis)（ATCC19420）和大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC25922）分別由同濟醫科大學(xué)分子生物學(xué)教研室和微生物學(xué)教研室提供。本實(shí)驗用分支桿菌噬菌體Phage40和Phage 88由Albert Einstein大學(xué)的William Jacobs 教授提供。

　　二、方法

　　1．細菌培養： BCG及緩慢生長(cháng)分支桿菌在M7H9培養基中培養，恥垢分支桿菌等快速生長(cháng)分支桿菌在Suton培養基中培養，大腸桿菌在普通瓊脂培養基中培養。細菌濃度采用722分光光度計測量，吸光度(A)=1時(shí)的細菌數約為2×10⁹個(gè)。同時(shí)用倒置顯微鏡進(jìn)行微菌落計數。

　　2．分支桿菌噬菌體的增殖與分離：分支桿菌噬菌體在恥垢分支桿菌中增殖。噬菌體加入Suton培養液，繼續培養一段時(shí)間后終止培養，用賽氏漏斗過(guò)濾（采用0.45μm濾膜），保存濾液�；蛴霉腆w苦味酸培養基，在噬菌斑出現后用噬菌斑裂解液裂解后收集裂解液，0.45μm濾膜過(guò)濾，用氯化銫30 000 g進(jìn)行梯度離心純化。

　　3.分支桿菌噬菌體的計數：將分支桿菌噬菌體濃縮液先進(jìn)行一系列10倍梯度稀釋后加入在苦味酸培養基中生長(cháng)的恥垢分支桿菌菌苔中，培養48 h觀(guān)察噬菌斑并計算噬斑形成單位數（PFU）。

　　4.發(fā)光分析：蟲(chóng)熒光素（luciferin，德國BM公司，純度為99%）臨用前用Tris（pH 7.8）緩沖液配制成相應濃度。細菌離心后用M7H9培養液洗2次，然后重浮在原體積的培養液中，孵育過(guò)夜。1 ml菌液中加入10³ PFU/ml的分支桿菌噬菌體1 ml孵育24 h后，取100μl樣品于13 mm×75 mm的聚苯乙烯試管中，在最佳發(fā)光條件下（0.22 mmol/L熒光素 100 μl，0.1 mmol/L ATP 100 μl，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液100μl），LKB-1251發(fā)光儀中測量30 h內發(fā)光值。

　　5.發(fā)光分析測定各種細菌的耐藥性：標準菌株及分離株采用Mcfarland3.0濁度（細菌濃度10⁷ CFU/ml），洗后重浮于2 ml培養液中，加入不含Tween80的含利福平及不含利福平M7H9培養基中37 ℃培養24 h，加入10³滴度的相應噬菌體孵育24 h后測量發(fā)光值。含利福平培養基的配制為在M7H9培養基中加入相應濃度的利福平組成，同時(shí)測定不同的利福平濃度梯度對臨床分離耐藥株及標準株的作用曲線(xiàn)。陰性對照采用標準藥敏株H₃₇Ra減毒株，陽(yáng)性對照采用標準耐藥株H₃₇Rv強毒株。

　　6.測量和統計方法：每個(gè)因素做3管測發(fā)光值，每個(gè)值重復2次，每次發(fā)光測量測6 s的積分發(fā)光值。結果取均數±標準差表示，統計分析采用t檢驗。

　　結果

　　一、兩種噬菌體對不同細菌的發(fā)光分析

　　用兩種噬菌體分別對大腸桿菌、BCG、恥垢分支桿菌、結核分支桿菌菌株H₃₇Ra和H₃₇Rv進(jìn)行了發(fā)光檢測，結果表明：兩株噬菌體對分支桿菌有特異性，非分支桿菌的大腸桿菌發(fā)光值很低，與陰性對照相比差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05），各種分支桿菌的發(fā)光值均較高，與陰性對照相比差異均有顯著(zhù)性（P＜0.05）。用Phage40檢測分支桿菌時(shí)，發(fā)光值均在加入發(fā)光液后逐步上升，4 h左右達到最高值，以后逐步下降，在15 h后發(fā)光基本消失，所有分支桿菌的發(fā)光動(dòng)力學(xué)過(guò)程都基本相似，但發(fā)光值有所不同，其中BCG的發(fā)光值最高，最高值約為陰性對照的100倍；恥垢分支桿菌次之，最高值約為陰性對照的70倍；結核分支桿菌最低，H₃₇Ra和H₃₇Rv的最高發(fā)光值約為陰性對照的25倍。用Phage 88檢測分支桿菌時(shí)，發(fā)光值均在加入發(fā)光液后13 h左右達到最高值，以后逐步下降，在30 h后發(fā)光基本消失，所有分支桿菌的發(fā)光動(dòng)力學(xué)過(guò)程都基本相似，但發(fā)光值有所不同，其中BCG的發(fā)光值最高，約為陰性對照的200倍；恥垢分支桿菌次之，最高值約為陰性對照的150倍；結核分支桿菌最低，H₃₇Ra和H₃₇Rv約為陰性對照的50倍。

　　二、進(jìn)行藥敏試驗的利福平濃度篩選

　　為確定最佳的藥敏試驗濃度，采用系列梯度稀釋的利福平對藥敏株和耐藥株進(jìn)行發(fā)光分析，結果發(fā)現藥敏株和耐藥株在含不同濃度利福平培養基中的發(fā)光反應明顯不同。Phage40在發(fā)光反應開(kāi)始后4 h達到最高值，此時(shí)陽(yáng)性對照H₃₇Rv為94.3 mV，耐藥株在利福平濃度0.5 μg/ml時(shí)為84.95 mV，1 μg/ml時(shí)為80.45 mV，2 μg/ml時(shí)為76.34 mV；藥敏株在0.5 μg/ml時(shí)為36.37 mV，1 μg/ml時(shí)為15.16 mV，2 μg/ml時(shí)為5.118 mV，與陰性對照H₃₇Ra相比（0.544 mV）差別小于10 mV。Phage88在發(fā)光反應開(kāi)始后14 h達到最高值，此時(shí)陽(yáng)性對照H₃₇Rv為271.3 mV，耐藥株在利福平濃度0.5 μg/ml時(shí)為250.4 mV，1 μg/ml時(shí)為241.5 mV，2 μg/ml時(shí)為234.1 mV；藥敏株在反應后12 h達到最高發(fā)光值，在利福平0.5μg/ml時(shí)為146.3 mV ，1 μg/ml時(shí)為80.34 mV，2 μg/ml時(shí)為5.033 mV，與陰性對照H₃₇Ra（0.537 mV）相比差別小于10 mV�？梢�(jiàn)耐藥株在含利福平培養基中的發(fā)光值與陽(yáng)性對照比較，差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05），而藥敏株的發(fā)光值則隨利福平濃度的升高而明顯降低，差異有顯著(zhù)性（P＜0.001），在利福平2μg/ml濃度時(shí)藥敏株的發(fā)光值與陰性對照已無(wú)明顯區別（P＞0.05），而耐藥株的發(fā)光值未受顯著(zhù)性影響。通過(guò)該系列藥物濃度的篩選試驗，得到最適于利福平藥敏試驗的濃度為2μg/ml。在該濃度下可通過(guò)發(fā)光值明顯區別藥敏株和耐藥株。

　　三、兩種噬菌體對不同分支桿菌的利福平藥敏試驗結果

　　為判定噬菌體生物發(fā)光技術(shù)對不同分支桿菌的藥敏試驗的可行性及確定最佳實(shí)驗條件，采用2μg/ml利福平濃度對不同的噬菌體和分支桿菌進(jìn)行藥敏試驗，結果如下。

　　1.兩種噬菌體對標準株的利福平藥敏試驗：利福平濃度為2μg/ml，利用Phage 40對H₃₇Rv、H₃₇Ra、大腸桿菌和恥垢分支桿菌mc155進(jìn)行藥敏試驗，以4 h的發(fā)光值為標準，僅H₃₇Rv的發(fā)光值與陰性對照差異有顯著(zhù)性（P＜0.001），約為陰性對照的30倍，其他菌株的發(fā)光值均與陰性對照差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05）。同時(shí)又用Phage88對H₃₇Rv、H₃₇Ra、大腸桿菌和恥垢分支桿菌mc155進(jìn)行藥敏試驗，以12 h的發(fā)光值為標準，僅H₃₇Rv的發(fā)光值與陰性對照差異有顯著(zhù)性（P＜0.001），約為陰性對照的60倍（P＜0.001），其他菌株的發(fā)光值均與陰性對照差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05）。

　　2.兩種噬菌體對臨床耐單藥分離株的利福平藥敏試驗：利福平濃度為2μg/ml，用Phage 40對1株臨床分離的結核分支桿菌耐藥株和3株臨床分離的非耐藥結核分支桿菌株進(jìn)行藥敏試驗，以4 h的發(fā)光值為判斷標準，僅1株臨床分離的結核分支桿菌耐藥株的發(fā)光值與陰性對照差異有顯著(zhù)性（P＜0.001），約為陰性對照的20倍，3株臨床分離的非耐藥結核分支桿菌株的發(fā)光值均與陰性對照差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05）；同時(shí)又用Phage88對上述菌株進(jìn)行了藥敏試驗，以12 h的發(fā)光值為判斷標準，僅1株耐藥結核分支桿菌株的發(fā)光值與陰性對照差異有顯著(zhù)性（P＜0.001），約為陰性對照的60倍，3株非耐藥結核分支桿菌株的發(fā)光值均與陰性對照差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05）。表明噬菌體可區別利福平耐單藥株。Phage40的最高發(fā)光值在反應后4 h，Phage 88的最高發(fā)光值在反應開(kāi)始后12 h。

　　3.兩種噬菌體對臨床分離耐多種藥物株的利福平藥敏試驗：對臨床分離的耐多種藥物株進(jìn)行發(fā)光分析，結果發(fā)現在利福平濃度為2μg/ml時(shí)，各株的發(fā)光值分別為：Phage 40測定（反應后4 h）分離株1為73.45 mV、2為60.39 mV、3為79.46 mV、4為64.39 mV、5為4.927 mV、6為0.844 mV、陰性對照0.844 mV；Phage 88（反應后12 h）測定分離株1為265.5 mV、2為237.6 mV、3為260.4 mV、4為254.3 mV、5為5.467 mV、6為4.865 mV、陰性對照0.812 mV�？梢�(jiàn)分離株1、2、3、4為利福平耐藥株，5、6為利福平藥敏株。耐利福平的臨床分離株發(fā)光值與陰性對照比較差異有顯著(zhù)性（P＜0.005），不耐利福平的耐多種藥物株的發(fā)光值均與陰性對照差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05）。表明噬菌體可區分耐利福平的臨床耐多種藥物分離株。Phage40的最高發(fā)光值在反應后4 h，Phage 88的最高發(fā)光值在反應開(kāi)始后12 h。

表1　羅氏培養基與噬菌體生物發(fā)光方法結果比較

　　注：^*兩種方法所需時(shí)間的比較均為P＜0.01；^**在各藥物培養基中的平均時(shí)間；Ⅰ為異煙肼，S為鏈霉素

　　4.噬菌體生物發(fā)光檢測結果與羅氏培養基的比較: 從表1可見(jiàn)對11株臨床分離株、2株噬菌體的生物發(fā)光技術(shù)檢測的結果與羅氏培養基相比，符合率為100%，藥敏試驗時(shí)間為72 h。噬菌體生物發(fā)光技術(shù)有很好的敏感性和特異性，并且可在72 h內得到準確的結果，是一種極有應用前景的技術(shù)。

　　討論

　　一、噬菌體生物發(fā)光技術(shù)可特異地用于分支桿菌的藥敏試驗

　　噬菌體生物發(fā)光技術(shù)對非分支桿菌如大腸桿菌的發(fā)光值很低，與陰性對照比較差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05），而對各種分支桿菌的發(fā)光值卻較高，表明噬菌體對分支桿菌的特異性，也表明噬菌體生物發(fā)光技術(shù)的特異性。

　　在含利福平的培養基中，藥敏株與耐藥株的發(fā)光特性有明顯的區別。噬菌體對耐藥株的發(fā)光值在同等藥物濃度下比對藥敏株的發(fā)光值要高，表明抗結核藥利福平可抑制相應的藥敏株對熒光素酶的表達，而對耐藥株的熒光素酶表達無(wú)影響，利用該特性可對結核分支桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗分析。研究表明這與抗結核藥直接或間接作用于細菌的轉錄和翻譯過(guò)程有關(guān)。在結核分支桿菌內增殖的噬菌體對熒光素酶的表達有賴(lài)于細菌的轉錄和翻譯過(guò)程，這兩個(gè)過(guò)程受抑制后，噬菌體的增殖和表達熒光素酶的能力受到影響，使發(fā)光反應降低。利福平作為殺菌藥，對細菌這兩個(gè)過(guò)程作用較強，對敏感株的發(fā)光值影響出現較早，表現為藥敏株的最高發(fā)光值比耐藥株的最高發(fā)光值提前。與國外的報道^［1-5］相似。

　　噬菌體生物發(fā)光技術(shù)在標準株和各臨床分離株的藥敏試驗均得到有統計意義的發(fā)光結果，得到藥敏試驗結果的時(shí)間僅72 h，大大低于羅氏培養基的藥敏試驗時(shí)間。因此生物發(fā)光技術(shù)用于結核分支桿菌的快速藥敏試驗有遠大的前景，在新抗結核藥的篩選上也有很大的用處。

　　二、利福平藥敏試驗時(shí)濃度的選擇

　　利福平藥敏試驗時(shí)的利福平濃度梯度在不同的培養基中各不相同，在液體培養基中的濃度大多集中在0.5～10μg/ml之間，在不同的實(shí)驗中也稍有不同^［2-8］。我們參考其它實(shí)驗結果，采用了系列利福平濃度梯度進(jìn)行藥敏試驗比較，可見(jiàn)在利福平2μg/ml時(shí)藥敏株的發(fā)光值與陰性對照值無(wú)明顯差別，耐藥株的發(fā)光值不受影響，表明該系列濃度值適合于藥敏試驗，與Carriere等^［2］的結果相同。

　　三、兩株噬菌體在藥敏試驗中的結果差異

　　從實(shí)驗結果中可見(jiàn)在藥敏試驗中，兩株噬菌體的發(fā)光值有明顯差別，即溫敏株噬菌體Phage88對藥敏試驗的發(fā)光值和靈敏度均高于Phage 40，這也證明了溫敏株噬菌體的基因突變對噬菌體表達熒光素酶有一定的影響。Jacobs等^［1］認為Fflux插入的位點(diǎn)不同對Fflux的表達有一定的影響。Fflux插入的部位如在受體噬菌體的強順式作用元件作用范圍內，順式作用元件可控制重組噬菌體的操縱子的活性及其對Fflux表達的調控。他們還利用羥胺突變形成溫敏株噬菌體，并與原噬菌體對比，結果表明不同位點(diǎn)的突變對噬菌體突變株的裂解受體菌的能力和對Fflux的表達也有明顯不同的影響：噬菌體裂解受體菌的能力越弱，其表達Fflux的能力增強。這與Phage88發(fā)光值高但持續時(shí)間長(cháng)有關(guān)^［1-4］。

　　四、對臨床分離株的診斷符合率高

　　通過(guò)對Mcfarland 3.0濁度（實(shí)際細菌濃度10⁷CFU/ml）的各臨床分離株進(jìn)行利福平藥敏試驗結果顯示，耐藥株之間的發(fā)光值差別不大，但耐藥株與藥敏株的發(fā)光值有顯著(zhù)性差異，表明采用噬菌體生物發(fā)光技術(shù)可敏感地區分臨床分離株中對利福平的藥敏株和耐藥株。對臨床分離株的診斷結果可見(jiàn)噬菌體生物發(fā)光法檢測結果與羅氏培養基相比符合率一致，而且僅用72 h即可得到藥敏試驗結果，快速、準確。對臨床分離株進(jìn)行診斷和檢測均有很好的應用前景。

　　本實(shí)驗結果說(shuō)明，用重組噬菌體可進(jìn)行結核分支桿菌利福平藥敏情況的快速檢測，其結果與羅氏培養基結果一致，但時(shí)間明顯縮短，僅為3 d。尤其對耐利福平菌株的檢測和判斷具有很大的應用價(jià)值，值得推廣應用。

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