一、支原體簡(jiǎn)介

  支原體結構簡(jiǎn)單，缺乏細胞壁，僅有質(zhì)膜，胞體內有核蛋白體以及一個(gè)由環(huán)形雙鏈DNA分子組成的原核。支原體大小僅有0.1μm~0.3μm，最小直徑約為100nm，可通過(guò)細菌濾器，會(huì )干擾細胞培養等工作的進(jìn)行。由于其能形成絲狀與分枝形狀，故稱(chēng)為支原體。

  不同支原體利用的能源物質(zhì)不同，如肺炎支原體、人型支原體等可發(fā)酵葡萄糖，口腔支原體可水解精氨酸，還有解脲支原體可利用尿素作為能源。我們可通過(guò)發(fā)酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反應鑒別支原體。

  支原體營(yíng)養要求一般比細菌高，除必須的基礎營(yíng)養物質(zhì)外，還需添加10%~20%的動(dòng)物血清以提供支原體所需的助生長(cháng)因子。由于大多數的支原體兼性厭氧，有些菌株在活化分離時(shí)保持5%~10%二氧化碳環(huán)境生長(cháng)狀態(tài)更好。解脲支原體在厭氧條件下生長(cháng)更好。

  支原體無(wú)細胞壁，對滲透壓敏感，對抑制細胞壁合成的抗生素不敏感，因此可添加青霉素抑制細菌的生長(cháng)。由于滲透壓突變會(huì )導致支原體破裂死亡，因此培養支原體時(shí)，維持適宜的滲透壓顯得格外重要。此外，在支原體培養中，pH也是重要因素。

  支原體在固體平板培養基上的菌落狀態(tài)為煎蛋狀，這種菌落狀態(tài)也是因為支原體沒(méi)有細胞壁的緣故，支原體向培養基內部生長(cháng)形成“蛋黃”部分，支原體在培養基表面生長(cháng)便形成了“蛋清”部分。

二、肺炎支原體、口腔支原體檢驗依據及原理

  人肺炎支原體檢查法在2020年版《中華人民共和國藥典》中體現，要求使用支原體肉湯培養基（貨號為HB7025-2，可參考文章支原體肉湯培養基的原理和使用方法）培養監測肺炎支原體。具體操作要求為：將肺炎支原體稀釋至10^-7~10^-9，接種在支原體肉湯培養基中，每個(gè)稀釋度接種3支試管，置于36℃培養7-14天，觀(guān)察培養基變色結果。肺炎支原體可以發(fā)酵培養基中的葡萄糖，使培養基的pH值降低，遇指示劑酚紅使培養基變黃。

  豬肺炎支原體檢查的方法在中國藥典中無(wú)具體要求，我們可以參照人肺炎支原體檢查法。

  口腔支原體檢查法在2020年版《中華人民共和國藥典》中體現，要求使用精氨酸支原體肉湯培養基（貨號為HB7025-5）培養監測口腔支原體。具體操作要求為：將口腔支原體稀釋至10^-3~10^-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基中，每個(gè)稀釋度接種3支試管，置于36℃培養7-14天，觀(guān)察培養基變色結果�？谇恢г�體可以利用培養基中的精氨酸，使培養基pH值升高，遇指示劑酚紅使培養基變紅。

三、支原體固體平板培養的方法

  1.取活化的人肺炎支原體（活化支原體的方法可參照視頻：肺炎支原體的靈敏度試驗方法）、豬肺炎支原體分別接種至支原體肉湯中，并進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)�涂布適宜濃度的稀釋液100μL至支原體瓊脂固體平板上（貨號為HB7025-3），封口膜包住平板邊緣以提供微需氧環(huán)境且能有效避免一定的污染，直到培養至光線(xiàn)下可以看到針尖大小的菌落，人肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態(tài)如圖1所示。

圖1 人肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態(tài)

  豬肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態(tài)如圖2所示。

圖2 人肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態(tài)

  2.取活化的口腔支原體接種至精氨酸支原體肉湯中，并進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)�涂布適宜濃度的稀釋液100μL至支原體瓊脂固體平板上（使用貨號為HB7025-1；較HB7025-3不同點(diǎn)在于含精氨酸和酚紅），封口膜包住平板邊緣以提供微需氧環(huán)境且能有效避免一定的污染，直到培養至光線(xiàn)下可以看到針尖大小的菌落，口腔支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態(tài)如圖3所示。

圖3 口腔支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態(tài)

四、支原體染色方法及染色后鏡檢結果

  為了增加顏色的對比度，更好的觀(guān)察檢測支原體，可采用加染色液的方法對支原體進(jìn)行染色，染色還可有效排除氣泡的干擾。中國藥典采用的為指示細胞培養法即DNA染色法，需要借助特殊的熒光染料和熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。而一般的實(shí)驗室并不具備這樣的條件，因此可以使用更為簡(jiǎn)單的染色方法，借助兩種常用的染料及普通電子顯微鏡即可觀(guān)察。具體步驟為：將蕃紅染液或結晶紫染液（革蘭氏染色A液；HB8278）稀釋一定的倍數，直接加入到平板上染色10秒，之后用水沖洗掉，無(wú)需切割瓊脂塊，直接將平板放置于顯微鏡觀(guān)察，人肺炎支原體的染色鏡檢結果如圖4所示。

圖4 人肺炎支原體的染色鏡檢結果

  豬肺炎支原體的染色鏡檢結果如圖5所示。

圖5 豬肺炎支原體的染色鏡檢結果

  口腔支原體的染色鏡檢結果如圖6所示。

圖6 口腔支原體的染色鏡檢結果

五、注意事項

  支原體染色鏡檢方法可參考視頻：口腔支原體固體平板法及染色鏡檢，該視頻詳細展示了固體平板的制備方法及注意細節。

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