食品中沙門(mén)氏菌檢驗（2）—沙門(mén)氏菌生化鑒定

一、參考標準

  《GB4789.4-2016食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門(mén)氏菌檢驗》

二、沙門(mén)氏菌生化鑒定簡(jiǎn)介

  沙門(mén)氏菌生化反應較為復雜，不同的種群生化反應存在差異，參照標準可分為三步進(jìn)行確認：第一步通過(guò)三糖鐵瓊脂和賴(lài)氨酸脫羧酶反應進(jìn)行初步篩選，第二步結合靛基質(zhì)試驗、尿素酶試驗、氰化鉀試驗結果進(jìn)行確認，若第二步仍不能確認鑒定結果，根據第一第二步的生化反應類(lèi)型，可分為六種反應類(lèi)型，再進(jìn)行第三步的補充試驗進(jìn)行確認。

三、接種步驟

沙門(mén)氏菌生化鑒定結果判斷流程圖

  用接種針挑取沙門(mén)氏菌分離平板上的可疑菌落，劃線(xiàn)并穿刺接種至三糖鐵瓊脂斜面，同時(shí)接種賴(lài)氨酸脫羧酶培養基及氨基酸脫羧酶對照培養基，此時(shí)可同步接種蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗）、尿素酶培養基、氰化鉀對照培養基及試驗培養基，接種結束后劃線(xiàn)至營(yíng)養瓊脂平板，置于相應的培養條件下進(jìn)行培養。

  注意事項：挑取菌落時(shí)，要用接種針挑取可疑菌落中心，避免碰觸到其他菌落造成污染；劃線(xiàn)接種至營(yíng)養瓊脂平板培養后，注意觀(guān)察菌落純度，若出現了不同形態(tài)的菌落，說(shuō)明挑取的菌落不純，需挑取純化好的菌落重新進(jìn)行生化鑒定。

四、生化反應培養基介紹

  （1）三糖鐵瓊脂

  制備好的三糖鐵瓊脂應為紅色透明固態(tài)的高層斜面，接種方式為斜面劃線(xiàn)接種加底層穿刺接種。細菌產(chǎn)堿為紅色，用“K”表示，產(chǎn)酸為黃色，用“A”表示。若斜面和底層均為紅色（產(chǎn)堿），則記為“K/K”；若斜面為紅色（產(chǎn)堿），底層黃色（產(chǎn)酸），則記為“K/A”；若斜面和底層均為黃色（產(chǎn)酸），則記為“A/A”；若底層有黑色出現，則為硫化氫+；若出現斷層，則為產(chǎn)氣+。

  大多數沙門(mén)氏菌在三糖鐵上的反應為K/A，產(chǎn)氣，底層變黑有硫化氫產(chǎn)生；少數不產(chǎn)硫化氫的沙門(mén)氏菌在三糖鐵上的反應為K/A，產(chǎn)氣，底層無(wú)黑色出現；極少數分解乳糖的沙門(mén)氏菌在三糖鐵上的反應為A/A，產(chǎn)氣，底層變黑有硫化氫產(chǎn)生。

  注意事項：三糖鐵瓊脂培養時(shí)，斜面部分需要與空氣中的氧氣發(fā)生氧化反應，因此必須選用透氣性良好的試管塞；在使用即用型一次性試管時(shí)，需開(kāi)蓋透氣培養，嚴禁密閉培養（密閉培養會(huì )導致原本應顯紅色的斜面變成黃色）。詳情參考文章：三糖鐵瓊脂（TSI）試管使用及注意事項。

  （2）賴(lài)氨酸脫羧酶試驗

  此反應必須同時(shí)接種氨基酸脫羧酶對照生化管，細菌進(jìn)行賴(lài)氨酸脫羧酶反應時(shí)，首先分解培養基中的葡萄糖產(chǎn)酸使培養基變成黃色，然后再分解賴(lài)氨酸脫羧產(chǎn)堿，使培養基又變回紫色。因此，當氨基酸脫羧酶對照管變成黃色，賴(lài)氨酸脫羧酶生化管紫色時(shí)，即為賴(lài)氨酸脫羧酶反應陽(yáng)性；當氨基酸脫羧酶對照管盒賴(lài)氨酸脫羧酶生化管均為黃色時(shí)，即為賴(lài)氨酸脫羧酶反應陰性。

 

  b、e、f：賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性反應，紫色；a、c、d：賴(lài)氨酸脫羧酶陰性反應，黃色

  甲型副傷寒沙門(mén)氏菌賴(lài)氨酸脫羧酶反應為陰性，其他沙門(mén)氏菌的賴(lài)氨酸脫羧酶反應均為陽(yáng)性。

  注意事項：接種后需覆蓋液體石蠟；必須同時(shí)接種氨基酸脫羧酶對照管；若對照管和氨基酸脫羧酶生化管均為紫色，說(shuō)明試驗菌可能為氧化型細菌或產(chǎn)堿型細菌，不能判斷該反應的陰陽(yáng)性。詳情參考文章：賴(lài)氨酸脫羧酶試驗原理及現象。

 （3）靛基質(zhì)試驗

 接種待測菌至蛋白胨水培養基中培養結束后，需滴加Kovacs靛基質(zhì)試劑數滴，若出現玫紅色反應，即為靛基質(zhì)反應陽(yáng)性。

a、b：靛基質(zhì)陽(yáng)性反應，有玫紅色環(huán)；c、d：靛基質(zhì)陰性反應，有黃色環(huán)；e：空白對照

  絕大多數沙門(mén)氏菌靛基質(zhì)反應為陰性，個(gè)別沙門(mén)氏菌為靛基質(zhì)陽(yáng)性變體。

  （4）尿素酶試驗

  接種細菌培養結束后，若培養基變玫紅色，說(shuō)明細菌能夠分解尿素產(chǎn)堿，即為尿素酶陽(yáng)性反應，若培養基仍為橙紅色或變黃，說(shuō)明細菌不分解尿素，即為尿素酶陰性反應。

a、b、c、e：尿素酶陰性反應，變黃或橙紅色；d：尿素酶陽(yáng)性反應，變玫紅色。

  幾乎所有的沙門(mén)氏菌尿素酶均為陰性反應，極少出現尿素酶陽(yáng)性的變體沙門(mén)氏菌。

  （5）氰化鉀試驗

  需同時(shí)接種氰化鉀對照生化管，若試驗菌在無(wú)氰化鉀的對照管生長(cháng)（渾濁），在含氰化鉀的試驗管不生長(cháng)（澄清），則為氰化鉀反應陰性；若試驗菌在對照管和試驗管均能生長(cháng)（渾濁），則為氰化鉀反應陽(yáng)性。

d：氰化鉀陽(yáng)性反應，渾濁生長(cháng)；a、b、c：氰化鉀陰性反應，澄清不生長(cháng)

  注意事項：氰化鉀為劇毒產(chǎn)品，操作時(shí)需做好防護措施，建議使用商品化培養基更安全；若自行購買(mǎi)氰化鉀配制培養基，需格外小心，若出現泄漏，可使用次氯酸鈉溶液、84消毒液、漂白粉等進(jìn)行應急處理。

  （6）甘露醇、山梨醇、水楊苷、衛矛醇發(fā)酵：變黃為陽(yáng)性反應，不變色或變藍為陰性反應。

a、b、d：糖醇發(fā)酵陽(yáng)性，變黃；c、e：陰性反應，仍為藍綠色

  （7）丙二酸鹽利用試驗：變藍為陽(yáng)性反應，不變色或變黃為陰性反應。

b、c：丙二酸鹽利用試驗陽(yáng)性，變藍；a：丙二酸鹽利用試驗陰性，不變色

  （8）ONPG：變黃為陽(yáng)性反應，不變色為陰性反應。

a、b、e、f：ONPG陽(yáng)性反應，變黃；c、d、g：ONPG陰性反應，不變色

五、鑒定結果判斷

  1.若三糖鐵反應出現K/K，可直接排除沙門(mén)氏菌；

  2.若三糖鐵反應出現A/A，賴(lài)氨酸脫羧酶為陰性，可直接排除沙門(mén)氏菌；

  3.若三糖鐵反應出現A/A，同時(shí)賴(lài)氨酸脫羧酶為陽(yáng)性，或三糖鐵出現K/A，需結合硫化氫、靛基質(zhì)、尿素酶、KCN、賴(lài)氨酸脫羧酶試驗結果進(jìn)行下一步判斷。

  （3.1）若出現以下生化反應結果（H2S通過(guò)三糖鐵底層是否變黑進(jìn)行記錄判斷），可直接判斷為典型沙門(mén)氏菌屬。若KCN、賴(lài)氨酸、尿素酶三項有至少兩項與下表不符合，可直接排除沙門(mén)氏菌。

H2S	靛基質(zhì)	尿素酶	KCN	賴(lài)氨酸
+	-	-	-	+

典型沙門(mén)氏菌生化反應：H2S+，靛基質(zhì)-，尿素酶-，KCN-，KCN對照渾濁，賴(lài)氨酸脫羧酶+，氨基酸脫羧酶對照變黃

  （3.2）若出現以下生化反應結果（靛基質(zhì)陽(yáng)性），有可能為沙門(mén)氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體，需補做甘露醇、山梨醇發(fā)酵，并做血清學(xué)試驗。若甘露醇、山梨醇發(fā)酵結果為陽(yáng)性，血清學(xué)試驗凝集，可確認為沙門(mén)氏菌。

H2S	靛基質(zhì)	尿素酶	KCN	賴(lài)氨酸
+	+	-	-	+

  靛基質(zhì)陽(yáng)性變體沙門(mén)氏菌生化反應：H₂S+，靛基質(zhì)+，尿素酶-，KCN-，KCN對照渾濁，賴(lài)氨酸+，氨基酸脫羧酶對照變黃，山梨醇+，甘露醇+

  （3.3）若出現以下生化反應（尿素酶陽(yáng)性），有可能為沙門(mén)氏菌個(gè)別突變體，需做血清學(xué)試驗。若血清學(xué)試驗符合，可確認為沙門(mén)氏菌。

H2S	靛基質(zhì)	尿素酶	KCN	賴(lài)氨酸
+	-	+	-	+

尿素酶變體沙門(mén)氏菌生化反應：H2S+，靛基質(zhì)-，尿素酶+，KCN-，KCN對照渾濁，賴(lài)氨酸+，氨基酸脫羧酶對照變黃

  （3.4）若出現以下生化反應（硫化氫陰性），有可能為不產(chǎn)硫化氫沙門(mén)氏菌，需補做ONPG試驗。若ONPG為陰性，可確認為沙門(mén)氏菌。

H2S	靛基質(zhì)	尿素酶	KCN	賴(lài)氨酸
-	-	-	-	+

不產(chǎn)硫化氫沙門(mén)（非甲型副傷寒沙門(mén)氏菌）生化反應：H2S-，靛基質(zhì)-，尿素酶-，KCN-，KCN對照渾濁，賴(lài)氨酸+，賴(lài)氨酸脫羧酶對照變黃，ONPG-

  （3.5）若出現以下生化反應（硫化氫陰性，同時(shí)賴(lài)氨酸脫羧酶陰性），有可能為甲型副傷寒沙門(mén)氏菌，需做血清學(xué)試驗。若血清學(xué)試驗符合甲型副傷寒沙門(mén)氏菌特征，可確認為甲型副傷寒沙門(mén)菌。

H2S	靛基質(zhì)	尿素酶	KCN	賴(lài)氨酸
-	-	-	-	-

甲型副傷寒沙門(mén)菌生化反應：H2S-，靛基質(zhì)-，尿素酶-，KCN-，KCN對照渾濁，賴(lài)氨酸-，氨基酸脫羧酶對照變黃

  （3.6）若出現以下生化反應（KCN陽(yáng)性），可能為沙門(mén)氏菌IV群或V群，需補做衛矛醇、山梨醇、水楊苷、ONPG、丙二酸鹽試驗。若生化鑒定結果符合IV型或V型，可確認為沙門(mén)氏菌。

H2S	靛基質(zhì)	尿素酶	KCN	賴(lài)氨酸
+	-	-	+	+

   沙門(mén)氏菌IV群和V群生化反應：

項目	衛矛醇	山梨醇	水楊苷	ONPG	丙二酸鹽
沙門(mén)IV型	-	+	+	-	-
沙門(mén)V型	+	+	-	+	-

  沙門(mén)氏菌IV群在HBI沙門(mén)氏菌生化鑒定條上的反應結果：靛基質(zhì)-，尿素酶-，KCN+，KCN對照渾濁，賴(lài)氨酸+，氨基酸脫羧酶對照變黃，甘露醇+，山梨醇+，水楊苷+，丙二酸鹽-，ONPG-，衛矛醇-。

  沙門(mén)氏菌V群在HBI沙門(mén)氏菌生化鑒定條上的反應結果：靛基質(zhì)-，尿素酶-，KCN+，KCN對照渾濁，賴(lài)氨酸+，氨基酸脫羧酶對照變黃，甘露醇+，山梨醇+，水楊苷-，丙二酸鹽-，ONPG+，衛矛醇+。

  附：食品中沙門(mén)氏菌檢驗解析（1）—沙門(mén)氏菌分離 點(diǎn)擊查看

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