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    細胞培養中的支原體污染的預防及處理



    錄入時(shí)間:2011-9-29 17:30:57 來(lái)源:中國生命科學(xué)實(shí)驗技術(shù)

        Mycoplasma國內主要有三種譯名,醫學(xué)文獻譯為“支原體”(分枝原體,枝原體,類(lèi)菌質(zhì)體),動(dòng)物醫學(xué)文獻譯為“霉形體”或“支原體”,臺灣、香港則譯為微漿菌。

        支原體是目前已知一類(lèi)能在無(wú)生命培養基上生長(cháng)繁殖的最小的原核細胞型微生物。自然界分布廣泛,種類(lèi)多,有80余種,分為兩個(gè)屬:一為支原體屬(Mycoplasma),有幾十個(gè)種;另一為脲原體屬(Ureaplasma),僅有一種。與人類(lèi)感染有關(guān)的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。

    支原體無(wú)細胞壁,多呈不規則球狀、長(cháng)絲狀,可分枝,營(yíng)寄生共生或腐生。一般侵害對象為動(dòng)植物,可造成多種疾病。

        細胞培養(特別是傳代細胞)被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。國內外研究表明,95%以上是以下四種支原體:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和菜氏無(wú)膽甾原體(A.laidlawii),為牛源性。國外調查證明,大約有二十多種支原體能污染細胞,有的細胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。

        支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(某些支原體在人體是正常菌群)、培養基的污染、被污染細胞造成的交叉污染、實(shí)驗器材的污染、制備細胞的原始組織或器官的污染,等等。

        體外生長(cháng)的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒(méi)有抵抗能力,因此培養基應達到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染(如細菌、真菌、支原體、病毒等)、無(wú)其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染(如抗體、補體)。對于天然培養基,污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身,應當嚴格選材,嚴格操作。對于合成培養基,污染主要來(lái)源于配制過(guò)程,配制所用的水,器皿應十分潔凈,配制后應嚴格過(guò)濾除菌。

        由于體外培養細胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力,而且培養基中的抗生素抗污染能力有限,因而培養細胞一旦發(fā)生污染多數將無(wú)法挽回。支原體污染后,因為它們不會(huì )使細胞死亡可以與細胞長(cháng)期共存,培養基一般不發(fā)生渾濁,細胞無(wú)明顯變化,外觀(guān)上給人以正常感覺(jué),實(shí)則細胞手到多方面潛在影響,如引起細胞變形,影響DNA合成,抑制細胞生長(cháng)等。

        組織細胞培養工作中,可以從以下幾方面來(lái)預防支原體的污染:控制環(huán)境污染;嚴格實(shí)驗操作;細胞培養基和器材要保證無(wú)菌;在細胞培養基沖加入適量的抗生素。

        抗生素主要用于消毒培養液,是培養過(guò)程中預防微生物污染的重要手段,也是微生物污染不嚴重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同,應根據需要選擇。

        在細胞培養過(guò)程中如果發(fā)現破碎的細胞甚多,培養細胞需要頻繁改善營(yíng)養環(huán)境才能支持長(cháng)期傳代培養時(shí),應該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀(guān)察特殊的外觀(guān)變化,培養液也不渾濁。

        支原體污染細胞后,特別是重要的細胞株,有必要清除支原體,常用方法有:抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。要注意的是:支原體沒(méi)有細胞壁,故作用于細胞壁生物合成的抗生素,如內酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等是不敏感的;對多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐火藥。對支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內酯類(lèi)等,氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對支原體有較小的抑制作用。必要時(shí)更換所有培養用物。通常,濾過(guò)除菌的方法對支原體是沒(méi)有作用的。

        由于一些微生物,如支原體,病毒等能通過(guò)濾膜,所以過(guò)濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險,近年來(lái),60Co輻射滅菌技術(shù)在醫藥、食品等領(lǐng)域廣泛應用,由于輻射滅菌能夠徹底殺滅所有微生物。有試驗證實(shí)以2Mrad輻射處理的各培養基樣品達到了無(wú)菌要求,經(jīng)多批培養試驗,輻射滅菌安全可靠;輻射滅菌的培養基營(yíng)養性能不低于過(guò)濾組,證明輻射滅菌對培養基性能無(wú)不良影響;對血清的輻射滅菌試驗效果也表明60COγ射線(xiàn)不影響培養效果。把干粉培養基經(jīng)無(wú)菌操做定量分裝于滅菌容器內,輻射后以干粉原型貯藏,不但培養基的純凈性得到保障,而且營(yíng)養性能較過(guò)濾后以水溶液形式保存更穩定,對谷氨酰胺等這類(lèi)水溶液不穩定者特別合適。

        目前,有專(zhuān)門(mén)做支原體檢測的試劑盒,可以用細胞滴片檢測。市場(chǎng)上已有了新一代支原體抗生素M-Plasmocin(InvivoGen公司),能有效的殺滅支原體,又不影響細胞本身的代謝,而且處理過(guò)的細胞不會(huì )重新感染支原體。另外,配合支原體檢測試劑盒(市場(chǎng)上有售,如美國ICN公司的產(chǎn)品),可以幫助盡快發(fā)現支原體的污染。

     

     

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