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一、介紹
致瀉大腸埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli）是一類(lèi)能夠引起人類(lèi)腹瀉及其他胃腸道疾病的重要病原菌。作為大腸埃希氏菌（Escherichia coli）的致病性亞群，致瀉大腸埃希氏菌根據其毒力因子和致病機制的不同，可分為多種類(lèi)型，包括腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌（ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）以及腸集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）等。這些菌株通過(guò)污染食品、水源或接觸傳播，成為全球范圍內食源性疾病和腹瀉爆發(fā)的主要病因之一，尤其在衛生條件較差的地區，其危害更為顯著(zhù)。
隨著(zhù)全球食品貿易的快速增長(cháng)和飲食習慣的多樣化，食品安全問(wèn)題日益受到關(guān)注。致瀉大腸埃希氏菌因其廣泛的傳播途徑和較強的致病性，成為食品安全監測的重點(diǎn)對象�？焖�、準確地檢測和鑒定食品中的致瀉大腸埃希氏菌，對于預防食源性疾病、保障公眾健康以及維護食品安全體系具有重要意義。生化檢驗作為微生物檢測的重要手段之一，能夠通過(guò)菌株的代謝特性、酶活性等生化特征，對其進(jìn)行有效鑒定和分類(lèi)，為食品安全風(fēng)險評估和疾病防控提供科學(xué)依據。
本文旨在探討致瀉大腸埃希氏菌的生化檢驗方法，分析其在實(shí)際檢測中的試驗方法及注意細節。
二、生化試驗判別方法
致瀉大腸埃希氏菌檢驗用生化試驗分別為三糖鐵瓊脂（TSI）、蛋白胨水（色氨酸肉湯）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀肉湯（KCN）、氧化酶試紙試驗，其中氰化鉀肉湯包含氰化鉀試驗生化管和氰化鉀試驗對照，生化結果判別及試驗方法如表1所示。
表1 致瀉大腸埃希氏菌檢驗用生化試驗羅列
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產(chǎn)品名稱(chēng)及貨號 |
結果判別 |
培養時(shí)間（h） |
備注 |
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陽(yáng)性 |
陰性 |
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18-24 |
大腸埃希氏菌：斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸(黃色或紅色)，底層產(chǎn)酸(黃色) |
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紅色環(huán) |
不變色或黃色 |
18-24 |
加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑2-3滴 |
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紅色 |
不變色或黃色 |
18-24 |
/ |
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氰化鉀試驗生化管 |
對照和試驗生化管均渾濁 |
試驗生化管澄清，對照管渾濁 |
18-24 |
/ |
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藍色或藍紫色 |
不顯色 |
靜置30s~120s |
將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落涂在試紙上。在30 s內變?yōu)樗{色或藍紫色為強陽(yáng)性，2min內不變色為陰性。 |
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三、生化試驗檢驗方法及結果
本生化試驗可參考食品安全國家標準《GB4789.6-2016食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》，6.4生化試驗部分。從MAC和EMB選擇平板上挑取乳糖發(fā)酵、乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落，為分離純化，三區劃線(xiàn)于營(yíng)養瓊脂平板上，并于36℃±1℃培養18h~24h。本次示例試驗從MAC和EMB上共挑取四種菌落（標記為1號~4號）進(jìn)行劃線(xiàn)分離，如圖1所示，分離純化結果應保證三區有單菌落，如圖2所示，否則應繼續純化。
圖1 EMB和MAC平板上的1號~4號菌落
圖2 三區劃線(xiàn)分離純化示例
取純化培養物于1mL-2mL生理鹽水中，制備成高濃菌懸液，如圖3所示。
圖3 高濃菌懸液示圖
取純化培養物“之”字劃線(xiàn)并穿刺接種于三糖鐵瓊脂和尿素瓊脂，于36℃±1℃培養18h~24h。試驗結果如圖4所示。
圖4 三糖鐵瓊脂和尿素瓊脂試驗結果
由圖4可知，1、3號菌落TSI瓊脂變黑，說(shuō)明產(chǎn)H2S陽(yáng)性，可直接判別為非大腸埃希氏菌。
同時(shí)取高濃菌懸液100μL至蛋白胨水、氰化鉀肉湯、氰化鉀試驗對照管中，于36℃±1℃培養18h~24h。試驗結果如圖5所示。
1、3號試驗結果相同 2、4號試驗結果相同
圖5 氰化鉀和蛋白胨水試驗結果
由圖4、圖5可知，2、4號菌落TSI斜面產(chǎn)酸（變黃）、底層產(chǎn)酸（變黃）、產(chǎn)H2S陰性（TSI瓊脂不變黑），靛基質(zhì)陽(yáng)性（蛋白胨水滴加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑后變紅）和尿素瓊脂陰性（變黃），因此，基本可判別2、4號菌落為大腸埃希氏菌，為進(jìn)一步驗證，對其進(jìn)行氧化酶試驗及革蘭氏染色，氧化酶試驗結果陽(yáng)性及革蘭氏染色結果陰性，如圖6所示。
圖6 氧化酶試制試驗及革蘭氏染色結果
至此，可判別該樣品中存在大腸埃希氏菌，為進(jìn)一步判別致瀉大腸埃希氏菌，應進(jìn)行PCR確認試驗。
四、HBI致瀉大腸埃希氏菌生化鑒定條產(chǎn)品推薦
我公司產(chǎn)品全面，單一產(chǎn)品如表1所示（已附貨號），為方便廣大用戶(hù)，還可使用“一站式”BHI致瀉大腸埃希氏菌生化鑒定條，該鑒定條包含所有生化試驗，貨號為HBIG12-1，如圖7所示。
圖7 BHI致瀉大腸埃希氏菌生化鑒定條
五、注意事項
1.三糖鐵瓊脂的配制、試驗方法可參考視頻“三糖鐵實(shí)驗操作視頻”。
2.氰化鉀試驗的方法及注意事項可參考文章“KCN生化反應注意事項”。
3.氧化酶試紙試驗方法可參考視頻“氧化酶實(shí)驗”。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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