KCN生化反應注意事項

一、簡(jiǎn)介

  KCN試驗是腸桿菌科各屬間的重要鑒別試驗方法之一，可將沙門(mén)氏菌屬和志賀氏菌屬與其他腸道菌屬相區別。

  其原理是KCN可以抑制某些細菌的呼吸酶系統，細胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，KCN能和鐵卟淋結合，使這些酶失去活性，使細菌生長(cháng)受到抑制。

二、試驗說(shuō)明

  在做KCN試驗時(shí)，需要同時(shí)接種KCN反應管和KCN對照管，按照一定條件培養足夠時(shí)間后，KCN反應管中無(wú)菌生長(cháng)（澄清），對照管中有菌生長(cháng)（渾濁），或者反應管不如對照管渾濁，則判定為KCN試驗陰性。

三、操作要點(diǎn)

  做微生物的生化鑒定時(shí)，為了達到較好的試驗效果，通常會(huì )使接種的菌液盡量濃，對于一些通過(guò)顏色變化判斷結果的生化試驗，這是非常有效的方法（見(jiàn)“生化鑒定條使用注意事項及討論”），但因為KCN試驗是通過(guò)澄清度來(lái)判斷結果，如果一開(kāi)始加入的菌量很多，就可能會(huì )使反應管尚未培養即有肉眼可見(jiàn)的渾濁，這樣就不好判斷究竟是陽(yáng)性還是陰性。特別是使用生化鑒定條類(lèi)產(chǎn)品時(shí)，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)建議每孔加入100μL菌懸液（菌懸液制備：取一內盛2mL無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水試管，用接種針從營(yíng)養瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落至無(wú)菌生理鹽水中仔細研磨制成均一細菌懸液，每孔加入100μL菌懸液。參考HBI沙門(mén)氏菌生化鑒定條(GB)）。這樣一來(lái)，如果菌懸液濃度過(guò)高，更容易出現假陽(yáng)性現象（如圖1）。

圖1  菌懸液過(guò)濃產(chǎn)生的假陽(yáng)性結果（左：對照管   右：反應管）

  為了避免這種情況的發(fā)生，在做KCN試驗時(shí)，可采用如下幾種方法接種（結果對比如圖2）：

（1）用接種環(huán)蘸取一環(huán)稀釋菌液，接種至生化管；

（2）用接種針直接沾取少量菌苔接種至生化管；

（3）如若統一使用每孔加入100μL的形式進(jìn)行接種，則應使用稀菌液，菌液的加入不會(huì )造成生化管肉眼可見(jiàn)的渾濁。

圖2  不同接種方式培養后的試驗結果

  GB4789.4-2016中，即采用的是第2種方法（截圖如下）。

  標準中同時(shí)還特別指出，“試驗失敗的主要原因是封口不嚴，KCN逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長(cháng)，因而造成假陽(yáng)性反應。試驗時(shí)對每一環(huán)節都要特別注意�！�

  在使用我公司成品生化管做沙門(mén)氏菌時(shí)，不管封口還是開(kāi)口培養，顯示的結果均是一致的（如圖3），但是為了試驗的嚴謹性，我們還是建議將KCN生化管進(jìn)行封口培養。

圖3  封口培養和開(kāi)口培養的試驗結果

四、注意事項

  另外，還需要提醒一下，KCN是劇毒藥，使用時(shí)應小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養基應在低溫環(huán)境中進(jìn)行。即使使用成品生化管，也應盡量在通風(fēng)環(huán)境中操作。

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