三種支原體固體平板計數法

一、平板計數法的介紹

  現中國藥典對培養基靈敏度的檢查方法采用的是變色單位試驗法（CCU法），即是將肺炎支原體ATCC 15531、口腔支原體ATCC 23714分別接種至支原體肉湯、精氨酸支原體肉湯中，于36℃±1℃培養至培養基變色，盲傳兩代后，將培養物接種至待檢培養基中，做10倍系列稀釋?zhuān)�肺炎支原體稀釋至10^-7~10^-9，接種在支原體肉湯培養基內；口腔支原體稀釋至10^-3~10^-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基內。每個(gè)稀釋度接種3支試管，置36℃±1℃培養7d~14d，觀(guān)察培養基變色結果。

  美國藥典已舍棄了變色單位試驗法，現使用的是平板計數法（CFU法），即是向100mL液體培養基和至少9 mL固體培養基中接入不超過(guò)100CFU的支原體，接種的支原體至少包含一株葡萄糖發(fā)酵型菌株（肺炎支原體或等效菌株）以及一株精氨酸水解型菌株（口腔支原體），液體培養基于36℃±1℃密閉容器中培養，固體培養基于36℃±1℃、5%~10% CO₂、濕潤環(huán)境中培養。

  對比CCU和CFU法，顯然CFU法對支原體的培養要求更為苛刻。采用CFU法，可更直觀(guān)的觀(guān)察支原體的菌落形態(tài)，也可對支原體的菌數進(jìn)行計算。

二、肺炎支原體、口腔支原體檢驗依據

  人肺炎支原體、豬肺炎支原體、口腔支原體液體培養的試驗方法依據于2020年版《中華人民共和國藥典》，以上支原體固體平板培養的試驗方法依據于《美國藥典》。以上支原體固體平板培養的方法以及染色方法可參考文章《人肺炎支原體、豬肺炎支原體、口腔支原體固體平板法及染色鏡檢》-點(diǎn)擊查看，這里不再敘述。

  人肺炎支原體、豬肺炎支原體固體平板計數用培養基推薦如表1所示，不同點(diǎn)在于，人肺炎支原體培養應搭配馬血清或牛血清使用，豬肺炎支原體培養應搭配豬血清使用。

表1 肺炎支原體固體平板計數法推薦用培養基

  口腔支原體固體平板計數用培養基如表2所示，口腔支原體應搭配馬血清或牛血清使用。

表2 口腔支原體固體平板計數法推薦用培養基

三、試驗方法

  本次肺炎支原體、口腔支原體固體平板計數法使用的培養基分別是BHI、精氨酸支原體肉湯。

  平板的配制方法參考文章《豬肺炎支原體在固體平板上的培養方法及染色鏡檢》，這里不再敘述。使用BHI疫苗專(zhuān)用培養基肉湯、精氨酸支原體肉湯作為稀釋液，將肺炎支原體、口腔支原體原液梯度稀釋至10-9。

  人肺炎支原體固體平板計數法：吸取人肺炎支原體原液10^-1~10^-5稀釋液共六個(gè)濃度分別涂布至BHI瓊脂平板，涂布量為100 μL，10^-1~10^-9稀釋液與固體平板均放置于36℃±1℃培養箱中培養，培養7d~21d。這里應注意，有條件的，需將平板置于5%~10%二氧化碳培養箱中正置培養，同時(shí)保持濕潤環(huán)境，沒(méi)有條件的，需使用封口膜對平板縫隙處進(jìn)行封膜處理。

  豬肺炎支原體固體平板計數法：吸取豬肺炎支原體原液10^-1~10^-5稀釋液共六個(gè)濃度分別涂布至BHI瓊脂平板，涂布量為40μL（特制平板涂布量少較佳），10^-1~10^-9稀釋液與固體平板均放置于36℃±1℃培養箱中培養，培養7d~21d。這里同人肺炎支原體固體平板培養的注意事項，此外，豬肺炎支原體較人肺炎支原體對潮濕環(huán)境的要求更高。

  口腔支原體固體平板計數法：吸取口腔支原體原液10^-1~10^-5稀釋液共六個(gè)濃度分別涂布至精氨酸支原體瓊脂平板，涂布量為100μL，10^-1~10^-9稀釋液與固體平板均放置于36℃±1℃培養箱中培養，培養7d~14d即可�？谇恢г�體較肺炎支原體易于培養。

四、人肺炎支原體計數結果

  如圖1所示，培養至13d時(shí)，人肺炎支原體稀釋液10^-1~10^-8稀釋管變至黃色。

圖1 人肺炎支原體稀釋液培養至13d

  培養至7d時(shí)，人肺炎支原體高濃度涂布平板可見(jiàn)支原體菌落，持續培養至17d時(shí)，低濃度平板上可見(jiàn)支原體菌落，10^-1~10^-4涂布平板如圖2所示。為更好的展示菌落形態(tài)，截取平皿表面局部的菌落，此外，低濃度涂布平板表面上的菌落不易拍照，需對光拍照。

10^-1                         10^-2

10^-3                         10^-4

        圖2 人肺炎支原體在固體平板上涂布的結果

  由圖2可知，10-4涂布平板表面單菌落清晰可見(jiàn)（肉眼觀(guān)察較圖片更為清晰），可進(jìn)行精確計數，10^-4平板表面菌落均數為230個(gè)（應注意圖片為平板表面局部圖，并非展示了所有菌落），該菌數是由10^-4稀釋液涂布100μL菌液得到的，由于稀釋液體系為10mL，則可推算1mL原液菌數為2.3×10⁷CFU人肺炎支原體，則10^-8稀釋液理論接入了約2CFU人肺炎支原體，10^-9稀釋液未有菌接入，結合圖1可知，添加約2CFU人肺炎支原體可使支原體肉湯培養至13d時(shí)有顏色變化。

  應注意的是，由于梯度稀釋存在一定的誤差，若振蕩不均勻，可能導致10^-8稀釋管未有菌接入，結果即是無(wú)論延長(cháng)培養多少天，10^-8稀釋管均不會(huì )發(fā)生變色；誤差也可能導致10^-9接入了菌，結果即是延長(cháng)培養一定天數后，10^-9稀釋管也會(huì )發(fā)生顏色變化。

  為驗證該菌落為人肺炎支原體，對該菌落進(jìn)行染色，染色鏡檢圖片如圖3所示。

圖3 人肺炎支原體染色鏡檢

五、豬肺炎支原體計數結果

如圖4所示，培養至12d時(shí)，豬肺炎支原體稀釋液10^-1~10^-9稀釋管變至黃色。

圖4 豬肺炎支原體稀釋液培養至12d

  培養至7d時(shí)，豬肺炎支原體高濃度涂布平板可見(jiàn)支原體菌落，持續培養至14d時(shí)，低濃度平板上可見(jiàn)支原體菌落，10^-2~10^-5涂布平板如圖5所示。為更好的展示菌落形態(tài)，截取平皿表面局部的菌落，此外，低濃度涂布平板表面上的菌落不易拍照，需對光拍照。

 10^-2                         10^-3

10^-4                         10^-5

        圖5 豬肺炎支原體在固體平板上涂布的結果

  由圖5可知，10^-5涂布平板表面單菌落清晰可見(jiàn)（肉眼觀(guān)察較圖片更為清晰），可進(jìn)行精確計數，10^-5平板表面菌落均數為140個(gè)（應注意圖片為平板表面局部圖，并非展示了所有菌落），該菌數是由10^-5稀釋液涂布40μL菌液得到的，由于稀釋液體系為10mL，則可推算1mL原液菌數為3.5×10⁸CFU豬肺炎支原體，則10^-9稀釋液理論接入了約4CFU豬肺炎支原體，結合圖4可知，添加約4CFU豬肺炎支原體可使支原體肉湯培養至12d時(shí)有顏色變化。

  為驗證該菌落為豬肺炎支原體，對該菌落進(jìn)行染色，染色鏡檢圖片如圖6所示。

圖6 豬肺炎支原體染色鏡檢

六、口腔支原體計數結果

  如圖7所示，培養至8d時(shí)，口腔支原體稀釋液10^-1~10^-7稀釋管變至粉紅，延長(cháng)培養至12d時(shí)，10^-8稀釋管也變至粉紅。

圖7 口腔支原體稀釋液分別培養至8、12d

  培養至3d~5d，口腔支原體高濃度涂布平板可見(jiàn)支原體菌落，持續培養至8d時(shí)，低濃度平板上可見(jiàn)支原體菌落，10^-1~10^-4涂布平板如圖8所示。為更好的展示菌落形態(tài)，截取平皿表面局部的菌落。

10^-1                         10^-2

10^-3                         10^-4

圖8口腔支原體在固體平板上涂布的結果

  由圖8可知，10^-4涂布平板表面單菌落清晰可見(jiàn)（肉眼觀(guān)察較圖片更為清晰），可進(jìn)行精確計數，10^-4平板表面菌落均數為172個(gè)（應注意圖片為平板表面局部圖，并非展示了所有菌落），該菌數是由10^-4稀釋液涂布100μL菌液得到的，由于稀釋液體系為10mL，則可推算1mL原液菌數為1.72×10⁷CFU口腔支原體，則10^-8稀釋液理論接入了約2CFU口腔支原體，添加17CFU口腔支原體可使精氨酸支原體肉湯培養至8d時(shí)有顏色變化，添加約2CFU口腔支原體可使精氨酸支原體肉湯培養至12d時(shí)有顏色變化。

  若培養相同時(shí)間，口腔支原體較肺炎支原體菌落要大許多，將10^-4稀釋濃度涂布的平板延長(cháng)培養至14d，口腔支原體的菌落狀態(tài)如圖9所示。

圖9 延長(cháng)培養至14d的平板表面的口腔支原體

  為驗證該菌落為口腔支原體，對該菌落進(jìn)行染色，染色鏡檢圖片如圖10所示。

圖10 口腔支原體染色鏡檢

注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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