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弧菌的培養保存方法和菌懸液制備

許英俊
錄入時(shí)間:2021-11-19 14:10:05 來(lái)源：青島海博生物

一、弧菌簡(jiǎn)介
弧菌是一種可以在溫帶水環(huán)境下發(fā)現的細菌屬。他們通常具有共同的特征和習性。如：
（1）革蘭氏陰性，短小彎曲弧狀，無(wú)芽孢，多數有鞭毛、菌毛（如圖1）；
（2）具有一端單生鞭毛，運動(dòng)迅速；
（3）多數菌株生長(cháng)需要2%-3%氯化鈉；
（4）最適生長(cháng)溫度為30℃-37℃；
（5）對熱敏感，90℃ 1min即可殺死，50℃ 20min或65℃ 5min也可達到殺菌效果；

（6）耐堿怕酸，1%醋酸或50%食醋中1min死亡。

圖1 弧菌的顯微形態(tài)

二、樣品處理規定
對于可能含有弧菌的樣品的保存和檢驗，各相關(guān)標準均作了規定：
（1）非冷凍樣品采集后應立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗（GB4789.7-2013 食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗）；
（2）新鮮樣品采集后應于3h內完成檢驗，若不能在規定時(shí)間內完成，則應將樣品置于7℃～10℃條件下保存，并盡可能在24h內完成檢驗（GB4789.44-2020 食品微生物學(xué)檢驗創(chuàng )傷弧菌檢驗）；
（3）樣品采集后應立即在7℃～10℃保存，24h內檢驗。如果樣品需要冷凍，于-18℃保存，24h內檢驗。為了最大限度地保證弧菌的存活率，應避免樣品與冰直接接觸（SN/T 1022-2001 進(jìn)出口食品中霍亂弧菌檢驗方法）。

通常來(lái)說(shuō)，樣品保存需放在4℃條件下，但弧菌檢驗標準中，對樣品的保存條件，均要求7℃～10℃，特意避開(kāi)了4℃，這是因為創(chuàng )傷弧菌在4℃條件下極易形成活而不可培養的狀態(tài)（參考GB4789.44-2020 食品微生物學(xué)檢驗創(chuàng )傷弧菌檢驗）。

三、保存溫度
基于弧菌對溫度的敏感性，實(shí)驗室在保存弧菌的標準菌株的時(shí)候，也要注意溫度條件。對于儲備菌株，有條件的可以保存在-70℃超低溫冰箱中，一般室溫指25℃左右，因為白天晚上會(huì )有溫差，除非有溫控設備，否則沒(méi)辦法保證一般環(huán)境溫度在25℃-28℃之間，其實(shí)只要溫度不是太高，放在室內環(huán)境中短期內是沒(méi)有問(wèn)題的。
對于真空冷凍干燥的菌株，未開(kāi)封狀態(tài)下于-20℃冰箱中至少可以保存2年。
對于工作菌株，本實(shí)驗室在長(cháng)期工作實(shí)踐中發(fā)現，由于冬天室溫偏低（不高于10℃），也不利于弧菌的保存。一周內所劃平板，盡管也有尚存活的弧菌，但其活力已遠不能滿(mǎn)足試驗可靠性需要，因此為能保證每次試驗的可靠性，建議每次接菌都用前一天在3%NaCl TSA平板上劃線(xiàn)培養所得的新鮮菌落；為保證試驗的連續性，在試驗階段應該每天劃平板培養；培養好的平板，用完后直接放回培養箱，當天下午下班前拿出滅菌丟棄。

務(wù)必記住，弧菌液體試管和劃線(xiàn)后的平板，一定不能放置在4℃冰箱中。

四、純化培養與菌懸液制備
因為多數弧菌具有嗜鹽性，而在無(wú)鹽的環(huán)境中生長(cháng)不好甚至不生長(cháng)，因此在培養該菌時(shí)，通常需要加入2%-3%的NaCl，而在初步篩選出該菌后進(jìn)行純化時(shí)，各標準都要求用含3%NaCl的營(yíng)養瓊脂進(jìn)行純化，也是基于這個(gè)原因。
為方便副溶血性弧菌的鑒定，我公司開(kāi)發(fā)出了副溶血性弧菌鑒定條和嗜鹽試驗系列生化管（編號分別為HBIS02、GS014、GS015、SN052、GS016），在使用這些產(chǎn)品時(shí)，需要挑取純化的菌落做成菌懸液，再往管中滴加，此時(shí)需要注意，務(wù)必使用0.85%生理鹽水進(jìn)行菌懸液的制備，而不能用無(wú)菌純凈水，并且制成菌懸液后要盡快滴加完畢，否則會(huì )影響結果的判定。
試驗證明，用生理鹽水制備的菌液，放置1h后菌數降低至初始狀態(tài)的50%左右；而用純水制備的菌液，放置1小時(shí)幾乎無(wú)活菌。即使稀釋后立即涂布，純水懸液中的菌數也會(huì )迅速降至生理鹽水稀釋液中菌數的10%以下（如圖2）。

圖2 副溶血性弧菌ATCC 17802用純水和生理鹽水稀釋后放置不同時(shí)間后的菌數

綜上所述，為保證菌種的存活，弧菌菌種應在-70℃超低溫保存或室溫，一定不能放在4℃環(huán)境保存；為保證試驗結果的準確性，弧菌鑒定試驗中，應該盡量用新鮮的菌板，挑單菌落至無(wú)菌生理鹽水制成菌液，制成的菌液不宜擱置時(shí)間太長(cháng)，必要時(shí)需要重新制備。

相關(guān)產(chǎn)品：

HBI副溶血性弧菌生化鑒定條(SN)-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

10%NaCl胰胨水-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

8%NaCl胰胨水-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

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3%NaCl胰胨水-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

相關(guān)標準：

GB 4789.7-2013 副溶血性弧菌檢驗點(diǎn)擊下載

GB 4789.44-2020 食品微生物學(xué)檢驗創(chuàng )傷弧菌檢驗點(diǎn)擊下載

SNT1022-2010 進(jìn)出口食品中霍亂弧菌的檢測方法點(diǎn)擊下載

注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。

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