乳酸菌檢驗的計數方法與規則詳解

 一、 引言

  前期曾介紹了乳酸菌的分類(lèi)和乳酸菌檢驗所用的幾種主要培養基，本文將進(jìn)一步就GB 4789.35中乳酸菌檢驗時(shí)所用的計數方法和規則進(jìn)行詳細解讀。

二、計數方法

  《GB 4789.35 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》中，主要涉及了3種乳酸菌，分別為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌屬。由于3種乳酸菌的培養條件和特征各有不同，要檢驗出樣品中乳酸菌的總數，就需要根據菌種的不同選擇使用合適的培養基，對結果進(jìn)行計數。標準中是這樣規定的:（表1）

  其中：

  6.2.3.2 是使用改良MRS培養基傾注，厭氧培養，對雙歧桿菌進(jìn)行計數；

  6.2.3.3 是使用MC培養基傾注，需氧培養，對嗜熱鏈球菌進(jìn)行計數；

  6.2.3.4 是使用MRS培養基傾注，厭氧培養，對乳桿菌（或乳桿菌與雙歧桿菌）進(jìn)行計數。

  從表中可以看出，在檢驗乳酸菌數量時(shí)，是分了3種情況分別進(jìn)行規定：

1、單一菌種的情況

  （1）只有雙歧桿菌時(shí)，使用MRS培養基或者雙歧桿菌瓊脂傾注、培養、計數；

  （2）只有乳桿菌時(shí)，使用MRS培養基進(jìn)行培養計數；

  （3）只有嗜熱鏈球菌時(shí)，使用MC培養基進(jìn)行培養計數。此處需要說(shuō)明一下，嗜熱鏈球菌在MRS上也能生長(cháng)良好（如圖1），所以當只有這種單一菌種存在時(shí)，日常工作中，如果不需要完全按照國標要求，是否可以使用MRS培養基進(jìn)行培養計數？

圖1 MRS上三種菌的生長(cháng)情況

  綜合比較，當只有單一菌種存在的情況下，如果不需要嚴格按照國標要求來(lái)操作，只需要將樣品稀釋后，取合適濃度用MRS培養基進(jìn)行傾注計數即可。MRS可以作為通用培養基使用。

2、兩種菌的情況

  如果樣品中有兩種菌存在，除了要檢驗出乳酸菌的總數外，有時(shí)還需要對其中各個(gè)菌種的數目進(jìn)行統計。

  （1）含有雙歧桿菌和乳桿菌時(shí)，使用MRS培養基對樣品進(jìn)行傾注后厭氧培養，即可得出兩種乳酸菌的總數；而如果還想知道里面所含雙歧桿菌的數目，則需要同時(shí)用改良MRS進(jìn)行傾注計數，改良MRS上長(cháng)出的菌落數，即為雙歧桿菌的數目。

  （2）含有雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌時(shí)，標準中使用改良MRS和MC進(jìn)行傾注計數，分別得出雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的數目，兩者加在一起即為菌落總數。采用改良MRS對雙歧桿菌進(jìn)行計數，這個(gè)沒(méi)有爭議，因為在改良MRS瓊脂中，只有雙歧桿菌能生長(cháng)，嗜熱鏈球菌不能生長(cháng)。

  在MC瓊脂上，雖然在厭氧條件下，嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌都能生長(cháng)（如圖2），但本標準中要求需氧培養，所以此時(shí)MC瓊脂上長(cháng)出的就只有嗜熱鏈球菌了。這個(gè)方法是可以達到計數嗜熱鏈球菌的目的的。

圖2 厭氧培養條件下MC瓊脂上雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的生長(cháng)狀態(tài)

  在日常工作中，如果不嚴格按照國標要求，我們也可以選擇使用MRS瓊脂和改良MRS瓊脂進(jìn)行傾注培養，MRS平板上所有菌落之和即為菌落總數，改良MRS平板上的菌數即為雙歧桿菌的菌數。

  （3）含有乳桿菌和嗜熱鏈球菌時(shí)，標準中采用MRS瓊脂厭氧培養和MC瓊脂需氧培養進(jìn)行計數，分別得出乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數目，兩者之和算作乳酸菌的總數。

  這一規定的問(wèn)題在于：因為這兩種菌都能在這兩種培養基上生長(cháng)良好，即MRS瓊脂上可以長(cháng)出乳桿菌和嗜熱鏈球菌（嗜熱鏈球菌在MRS培養基上厭氧培養的結果，如圖3），MC瓊脂上也能長(cháng)出乳桿菌和嗜熱鏈球菌，只是菌落大小的差異。其中在MRS瓊脂上，雖然多數乳桿菌菌落較大，但對于有些乳桿菌（如德氏乳桿菌CICC 6032），菌落直徑也很小，跟嗜熱鏈球菌很容易混淆（如圖3）。

圖3  MRS上德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌落形態(tài)

  同樣，兩種菌在MC瓊脂上的菌落形態(tài)如下圖（圖4）：

圖4 德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌在MC培養基上的菌落形態(tài)

  所以，要想從同一種培養基上，明顯地區分出兩種菌來(lái)，分別計數，確實(shí)也不容易。

  問(wèn)題的關(guān)鍵在于，標準中明確規定，將兩種培養基上培養出的菌數，進(jìn)行相加，即得乳酸菌總數。通過(guò)上面的分析，我們不難得出，這樣處理，得出的結果實(shí)際上是把乳酸菌總數翻倍了，即乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數目分別重復了兩遍，并且也不能明確得出每種乳酸菌的具體數目。

  綜合以上三種情況，我們可以總結為，在不需要嚴格按照標準操作的前提下，如果已知樣品中有兩種乳酸菌，要檢驗樣品中的乳酸菌總數，只要用MRS進(jìn)行傾注就可以了，平板上長(cháng)出的菌數即為乳酸菌總數；而要確切地知道其中某一種菌的數目，則要根據情況進(jìn)行培養基的選擇：使用改良MRS可以很容易得出雙歧桿菌的數目，使用MC可以勉強計出嗜熱鏈球菌的數目，但要注意避免其他菌種的干擾；對于乳桿菌的數目，只要用菌落總數減去已經(jīng)計出的另一種菌的數目即可。

3、三種菌的情況

  標準中規定，用MC需氧培養，得出嗜熱鏈球菌的數目；MRS厭氧培養，得出乳酸菌和雙歧桿菌的總數，最后將兩者加和，即為乳酸菌總數；如果要單獨檢驗雙歧桿菌的數目，則采用改良MRS瓊脂進(jìn)行厭氧培養后計數可得。

  這里同樣存在上面所述的問(wèn)題。

  對于標準中為什么這么寫(xiě)，我們可以理解成，它默認了在MRS瓊脂上嗜熱鏈球菌不會(huì )生長(cháng)，而在MC瓊脂上乳桿菌不會(huì )生長(cháng)？但這明顯是與我們實(shí)際操作情況不相符的。

  如果按照這種要求進(jìn)行計數，最終所得的數目，將會(huì )把乳桿菌和嗜熱鏈球菌重復計數。

  在日常工作中，如果不需要嚴格按照國標操作，要解決這一問(wèn)題，我們還是借助這兩種培養基，只要將MRS上長(cháng)出的所有菌落數出來(lái)，即為樣品中的菌落總數。而如果非要追究里面所含嗜熱鏈球菌的數目，只能借助MC瓊脂，計數時(shí)要仔細甄別，不要誤將乳桿菌計成了嗜熱鏈球菌，從而導致結果誤差；最后用菌落總數減去嗜熱鏈球菌的數目，即為乳桿菌的數目。

  這樣一來(lái)，我們可以將上面三種情況進(jìn)行總結，如下表：

表2  乳酸菌計數時(shí)培養基的選擇及計數方法表

注：表格中所有使用MC瓊脂的，均采用需氧培養方式；其它培養基均為厭氧培養

  通過(guò)表格，我們可以一目了然地對乳酸菌計數中使用的培養基進(jìn)行選擇：在不需嚴格按照國標要求進(jìn)行操作的情況下，不管樣品中含有幾種菌，只要求總數，統一用MRS瓊脂即可，MRS瓊脂可以算得上檢驗乳酸菌菌落總數的“王牌培養基”；在多種菌種共存的情況下，要想知道雙歧桿菌的數目，直接選擇改良MRS；對于嗜熱鏈球菌可以通過(guò)計算或MC傾注的方式得到，本人建議能計算的情況下，首選計算方法；而對于乳桿菌的數目，只能采用計算的方法得到，因為GB中并沒(méi)有一種特定的培養基，能將乳桿菌與其它種類(lèi)的乳酸菌區分開(kāi)來(lái)。

三、計數規則

  上面討論的三種乳酸菌的培養計數方法，當選用了合適的方法，培養出菌落后，怎么選擇合適的平板進(jìn)行計數，也是實(shí)驗人員要面臨的問(wèn)題。

  對于這一點(diǎn)，標準中逐條做出了規定，為了方便大家理解和掌握，筆者特整合成下面的圖示進(jìn)行說(shuō)明（圖5），希望能給廣大實(shí)驗人員提供幫助。

圖5 菌落計數規則

四、說(shuō)明

  在樣品（包括食品、藥品、化妝品等）檢驗過(guò)程中，檢驗人員應首先參考相應的標準進(jìn)行各項操作，只要標準沒(méi)有錯誤，就應該嚴格按照標準規定的條件和方法來(lái)檢驗，這樣才能保證檢驗結果的一致性和可靠性。但是，如果標準中的個(gè)別地方出現了明顯的疑義或者有些方法不利于正確結果的判斷，究竟該怎么處理，要具體情況具體分析。

相關(guān)文章： 

乳酸菌檢驗用培養基及生化反應詳解 點(diǎn)擊查看

相關(guān)產(chǎn)品： 

MRS培養基-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

MC培養基-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

相關(guān)標準：

《GB 4789.35-2016 乳酸菌檢驗》 點(diǎn)擊下載

注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。

上一篇：飲用天然礦泉水:糞鏈球菌檢驗方法及結果分析

下一篇：GB8538-2016飲用天然礦泉水：銅綠假單胞菌檢驗方法及結果分析