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乳酸菌檢驗用培養基及生化反應詳解

許英俊
錄入時(shí)間:2021-8-30 15:31:07 來(lái)源：青島海博生物

一、乳酸菌介紹：
乳酸菌是一類(lèi)可發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生大量乳酸的、無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細菌的通稱(chēng)。
主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和嗜熱鏈球菌屬（Streptococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和片球菌屬（Pediococcus）。

乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長(cháng)桿狀、彎曲桿狀或短桿狀（圖1）。

圖1 乳桿菌的顯微形態(tài)

雙歧桿菌呈短桿狀、纖細桿狀或球形,可形成各種分支或分叉等多形態(tài)，如Y字形、v字形、彎曲狀、勺形（圖2），典形形態(tài)為分叉桿菌，因而取名bifidus，不抗酸，無(wú)動(dòng)力。

圖2 雙歧桿菌的顯微形態(tài)

嗜熱鏈球菌菌體呈球形、卵圓形或球桿狀，直徑為0.5μm～2.0μm，成對或成鏈排列（圖3）。

圖3 嗜熱鏈球菌的顯微形態(tài)

二、檢驗標準和程序：

《GB4789.35-2016食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》中規定，乳酸菌的檢驗程序如下：

圖4 乳酸菌檢驗程序

該檢驗程序中，共涉及3種培養基，本文將對它們分別進(jìn)行詳細闡述。

三、主要培養基：
1、MRS培養基：
該產(chǎn)品主要用于食品中乳酸菌的分離培養和計數。

培養基成分（g/L）如下：

蛋白胨	10.0
牛肉浸粉	5.0
酵母浸粉	4.0
葡萄糖	20.0
磷酸氫二鉀	2.0
檸檬酸三銨	2.0
醋酸鈉	5.0
硫酸鎂	0.2
硫酸錳	0.05
瓊脂	15.0
吐溫80	1.0
pH值6.2±0.2	25℃

原理：
蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉提供氮源、維生素、生長(cháng)因子；葡萄糖為可發(fā)酵糖類(lèi)；磷酸氫二鉀為酸堿緩沖劑；檸檬酸三銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80和醋酸鈉為培養各種乳酸菌提供生長(cháng)因子，其成分還能抑制某些雜菌并中和細胞毒性物質(zhì)，為乳酸菌提供一個(gè)良好的生長(cháng)環(huán)境；瓊脂是培養基的凝固劑。
用法：
稱(chēng)取本品66.2g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15-20分鐘，備用。
質(zhì)控：
按標簽用法制備培養基，接種質(zhì)控菌株，放置36±1℃需氧培養48±2小時(shí)，觀(guān)察結果（表1、圖5）。

表1 MRS培養基上各質(zhì)控菌株的生長(cháng)情況要求

圖5 MRS瓊脂上各質(zhì)控菌株的生長(cháng)狀態(tài)

2、莫匹羅星鋰鹽和半胱甘酸鹽酸鹽改良MRS培養基：
顧名思義，就是通過(guò)添加某些成分對MRS培養基進(jìn)行了改良。其基礎與MRS相同，使用HB0384-5或HB0384-6都可以，每200mL培養基中加入過(guò)濾除菌的莫匹羅星鋰鹽10mg和半胱氨酸鹽酸鹽0.1g。使用海博公司的產(chǎn)品的實(shí)際添加量為：
莫匹羅星鋰鹽（HB0384-6a）：1支/100mL；
半胱氨酸鹽酸鹽（HB0384-11a）：1支/200mL。
原理：

莫匹羅星是一種抗生素，主要用于殺滅皮膚表面的革蘭氏陽(yáng)性球菌，對一些革蘭氏陰性細菌有一定的抗菌作用（圖6）。加入本培養基中，可以抑制乳桿菌和嗜熱鏈球菌等雜菌的生長(cháng)。

圖6 莫匹羅星鋰鹽添加劑及相關(guān)產(chǎn)品

L-半胱氨酸是一種具有生理功能、在自然界廣泛存在的重要物質(zhì)。它在動(dòng)植物體內是各組織細胞用來(lái)防御有害物質(zhì)和增加活力的一種氨基酸，并且是唯一具有活性巰基(-SH)的氨基酸，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、刺激生長(cháng)、增加脂肪分解、增強免疫的作用,添加在該產(chǎn)品中，可以使培養基維持較低的氧化還原電位，促進(jìn)厭氧菌雙歧桿菌的生長(cháng)（圖7）。

圖7 半胱氨酸鹽酸鹽添加劑及相關(guān)產(chǎn)品

用法：
稱(chēng)取本品66.2g，加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15-20分鐘，冷至48℃左右時(shí)，每200 mL培養基中加入過(guò)濾除菌的莫匹羅星鋰鹽10mg和半胱氨酸鹽酸鹽0.1g,混勻，傾入無(wú)菌平皿，備用。
質(zhì)控：
按標簽用法制備培養基，接種以下質(zhì)控菌株，放置36±1℃厭氧培養48±2小時(shí)，觀(guān)察結果（表2、圖8）。

表2 改良MRS培養基上各質(zhì)控菌株的生長(cháng)情況要求

圖8 改良MRS培養基上各質(zhì)控菌株的生長(cháng)狀態(tài)

3、MC瓊脂培養基：
該培養基主要用于食品中嗜熱鏈球菌總數測定。

成分(g/L)如下：

大豆蛋白胨	5.0
牛肉浸粉	3.0
酵母浸粉	3.0
葡萄糖	20.0
乳糖	20.0
碳酸鈣	10.0
瓊脂	15.0
中性紅	0.05
pH值6.0±0.1	25℃

原理：
大豆蛋白胨、牛肉膏粉和酵母膏粉能提供氮源、維生素和生長(cháng)因子；葡萄糖和乳糖為可發(fā)酵糖類(lèi)提供碳源；乳酸菌發(fā)酵糖產(chǎn)酸使菌落周?chē)妓徕}溶解，以辨別乳酸菌；瓊脂是培養基的凝固劑；中性紅為pH指示劑。
用法：
稱(chēng)取本品80.0g,加熱煮沸溶解于1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。
質(zhì)控：
按標簽用法制備培養基，接種以下質(zhì)控菌株，放置36±1℃需氧培養48±2小時(shí)，觀(guān)察結果（表3、圖9）。

表3 MC瓊脂上各質(zhì)控菌株生長(cháng)的要求

圖9 MC瓊脂上各質(zhì)控菌株的生長(cháng)情況

四、乳酸菌的生化鑒定：
有時(shí)為了確定菌種的種類(lèi)和純度，需要對接種的菌種或分離出的菌株做進(jìn)一步鑒定，乳酸菌最常用的生化鑒定方法就是碳水化合物的生化反應，下面對三種乳酸菌的生化反應現象逐一說(shuō)明。相關(guān)表格引自《GB4789.35-2016食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》和《GB4789.34-2016食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗雙歧桿菌檢驗》。
1、乳桿菌的碳水化合物反應
常見(jiàn)乳桿菌的碳水化合物反應標準和現象如表4。

表4 常見(jiàn)乳桿菌屬內種的碳水化合物反應

菌種	碳水化合物
菌種	七葉苷	纖維二糖	麥芽糖	甘露醇	水楊苷	山梨醇	蔗糖	棉子糖
植物乳桿菌	+	+	+	+	+	+	+	+
干酪乳桿菌	+	+	+	+	+	+	+	-
德氏乳桿菌	-	-	-	-	-	-	-	-

2、嗜熱鏈球菌的生化反應
常見(jiàn)嗜熱鏈球菌的主要生化反應標準和現象如表5。

表5 常見(jiàn)嗜熱鏈球菌的主要生化反應

菌種	菊糖	乳糖	甘露醇	水楊苷	山梨醇	馬尿酸	七葉苷
嗜熱鏈球菌	-	+	-	-	-	-	-

3、雙歧桿菌的主要生化反應
常見(jiàn)雙歧桿菌的主要生化反應標準和現象如表6。

表6 常見(jiàn)雙歧桿菌的主要生化反應

菌種	碳水化合物
菌種	鼠李糖	甘露醇	山梨醇	七葉苷	水楊苷	纖維二糖	乳糖	蔗糖	棉子糖	葡萄糖
嬰兒雙歧桿菌	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+
長(cháng)雙歧桿菌	-	-	-	+	-	-	+	+	+	+

五、注意事項：
在乳酸菌檢驗中，需要注意的地方有兩個(gè)，其一為樣品處理方式，其二為生化試驗細節。
1、樣品的稀釋?zhuān)裱Ｒ幱昧�，�?5.0g/mL樣品加入225g/mL生理鹽水中進(jìn)行稀釋。但是對于冷凍樣品，在稀釋之前首先要進(jìn)行解凍，對于解凍方式，標準作了明確規定：2-5℃條件下解凍，應少于18h或低于45℃條件下15分鐘內解凍完畢，然后進(jìn)行下一步操作。
2、在進(jìn)行生化反應的過(guò)程中需要注意：
（1）接菌：必須為培養基平板純培養出的新鮮培養物；
（2）覆蓋石蠟：標準中規定，對于厭氧菌要加入液體石蠟后進(jìn)行培養，但實(shí)際試驗表明，不管對于兼性厭氧菌還是嚴格厭氧菌，加不加石蠟結果均一致，這個(gè)并不影響結果的判斷，操作時(shí)盡量按照標準要求即可。
（3）培養時(shí)間：通常18h即可觀(guān)察結果，現象不明顯者可適當延長(cháng)至24h。
（4）標準比對：對于有些生化反應，雖然標準中列出呈陽(yáng)性或陰性反應，但實(shí)際試驗時(shí)并不能一定得到這種結果，也就是不能與標準達到100%的符合，這并不是生化管產(chǎn)品的問(wèn)題，可能是菌株差異所致，因為標準中所描述的陽(yáng)性和陰性反應，都是以90%以上的菌株為范圍的（如圖10），并不是絕對所有的菌株都能達到這種反應。對于偶爾出現的這種現象，要理性對待，可以視情況選擇其他的鑒定方法，對鑒定結論相互印證。

圖10 標準中對于生化反應符合性的備注說(shuō)明

補充說(shuō)明：

該標準涉及的內容較多，本次列出的是常規性的一些內容，有關(guān)計數方式和培養基的具體選擇問(wèn)題，將在后續的文章中繼續探討。

相關(guān)產(chǎn)品：

MRS培養基-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養基-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

MC培養基-點(diǎn)擊查看產(chǎn)品詳情

相關(guān)標準：

《GB 4789.35-2016 乳酸菌檢驗》點(diǎn)擊下載

《GB 4789.34-2016 雙歧桿菌檢驗》點(diǎn)擊下載

注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。

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