朊病毒的檢測（上）

朊病毒的檢測方法有如下幾種：
  

        1  動(dòng)物傳遞實(shí)驗   
        動(dòng)物實(shí)驗是判斷生物體是否感染朊病毒、測定感染滴度、研究朊病毒傳染性的主要手段。隨著(zhù)檢測技術(shù)的進(jìn)步，現在動(dòng)物實(shí)驗的許多功能已被更快捷、更準確的方法所代替，但作為生物學(xué)方法仍然是研究朊病毒不可缺少的重要環(huán)節。目前，已知的朊病毒病大多已建立了動(dòng)物感染模型，小鼠、大鼠和倉鼠是最常用的朊病毒實(shí)驗動(dòng)物。 
        常規方法是將無(wú)菌的組織標本，用Teflon研棒勻漿后作10倍連續稀釋?zhuān)�每個(gè)稀釋度通常腦內接種6只小鼠(10～30μl)、大鼠(30μl)或倉鼠(50μl)。接種動(dòng)物每3天檢查1次，發(fā)現其出現毛亂、弓背、運動(dòng)過(guò)慢和后肢癱瘓等病狀后逐日檢查，瀕死撲殺，取腦組織作病理學(xué)檢查，以驗證朊病毒感染。如接種動(dòng)物不發(fā)病，則繼續觀(guān)察至其死亡或適時(shí)盲傳，最后取腦組織作病理學(xué)檢查。根據動(dòng)物發(fā)病和死亡數計算滴度。該方法的優(yōu)點(diǎn)是比較敏感，是研究朊病毒生物學(xué)特性的重要實(shí)驗。其缺點(diǎn)是費時(shí)、費力，滴定誤差大，需消耗大量動(dòng)物，費用昂貴。由于種屬屏障和毒株、動(dòng)物個(gè)體差異等因素的影響，傳遞的成功率往往相差較大，個(gè)別 GSS毒株的動(dòng)物傳遞始終未獲成功。因此，實(shí)驗陰性并不能排除朊病毒感染，使用轉基因動(dòng)物是一條經(jīng)濟實(shí)用的削弱或消除種屬屏障的實(shí)驗途徑，可明顯改善傳遞效果。 
        2  免疫學(xué)方法   
        免疫學(xué)檢測方法由于其靈敏度高，特異性強，方法眾多，能適合不同檢驗要求的需要，目前已成為檢測朊病毒的最主要方法。 
        (1)組織印跡：組織印跡技術(shù)是將靈敏的蛋白檢測技術(shù)和解剖學(xué)組織保存技術(shù)結合起來(lái)，用于檢測組織中微量的PrPsc。其靈敏度較高，甚至可以超過(guò)一般的免疫印跡，已被廣泛地用于朊病毒的研究。 
        (2)斑點(diǎn)印跡：1990年，Serban等介紹了一種用硫氰酸胍處理的斑點(diǎn)印跡方法，將組織標本置于冷的裂解緩沖液中勻漿，然后500r/min離心5 min，去除不溶性殘渣，上清液與含SDS樣本緩沖液等量混合，吸取4μl混合液，點(diǎn)樣于干的NC膜上，空氣中干燥,iK消化，3mol/L硫氰酸胍處理，封閉后，進(jìn)行免疫學(xué)檢測。斑點(diǎn)印跡法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)便，對儀器設備要求低，適用大批量標本的篩查，易于普及推廣。 
        (3)免疫印跡：由于使用了凝膠電泳分離技術(shù)和免疫檢測技術(shù)，除了可以鑒定標本中特定的組分外，還能顯示其電泳分離圖譜，運用價(jià)值較高。免疫印跡技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，對儀器設備要求低，而且不受組織自溶的影響，能在組織病理學(xué)結果陰性或含糊的情況下檢出PrPres，具有早期確診價(jià)值。目前，已成為朊病毒研究中最常用的檢測方法之一。其基本步驟是：將待檢組織標本勻漿、離心、蛋白酶K消化等一系列處理后，在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，隨后將蛋白質(zhì)轉印至NC膜或PVDF膜上，封閉，用特異性抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。 
        (4)免疫組化：免疫組化是利用特異性抗體直接顯示組織切片上致病性PrP。由于可以對PrPres的沉積進(jìn)行精確的解剖學(xué)定位，為臨床病理學(xué)診斷提供客觀(guān)依據，因此，具有很高的臨床診斷價(jià)值。免疫組化可以檢測甲醛固定、石蠟包埋的組織標本，應用面較廣。其基本步驟是：將甲醛固定或石蠟包埋的組織標本經(jīng)一系列預處理后，依次與特異性抗體和酶標記第二抗體反應，最后加底物顯色，顯微鏡下觀(guān)察。 
        (5)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗：該方法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速、可定量、自動(dòng)化等特點(diǎn)，非常適合大批量標本的普查篩選工作。目前報道的用于檢測朊病毒的ELISA方法有兩種：一種是間接法，即先將從各個(gè)標本中提取的PrPres分別包被于酶標板的孔中；另一種是雙抗體夾心法，即先用特異性抗體包被酶標板，再加入標本提取物，37℃孵育。此后兩種方法都依次加入特異性1抗、酶標2抗，最后加底物顯色，酶標儀讀板。 

        (6)關(guān)于免疫學(xué)檢測中標本預處理的幾點(diǎn)說(shuō)明：①適當的標本預處理，可以暴露PrPres原先隱蔽的抗原表位和(或)修復被福爾馬林破壞的抗原表位，提高PrPres的免疫反應性，有利于實(shí)驗靈敏度的提高。②預處理并不是萬(wàn)能的，多種預處理都有失敗的事例，預處理的效果可能取決于預處理暴露或修復的抗原表位能否被實(shí)驗使用的抗體所識別。③某些預處理(如高壓蒸汽處理法)可同時(shí)增加PrPsen的免疫反應性，但這對PrPsen的檢測幫助不大，Yokoyama認為這僅僅是由于PrPsen表達太低造成的。④某些實(shí)驗使用的抗體不能分辨 PrPres和PrPsen，又沒(méi)有用PK消化以去除PrPsen，這些實(shí)驗采用預處理的目的主要是利用 PrPres和PrPsen對預處理反應的差異，篩選預處理條件，盡量增強所用抗體與PrPres的免疫反應性，抑制與PrPsen的免疫反應性，擴大二者實(shí)驗結果的差異，以達到篩查患感染TSE生物體的目的。⑤不進(jìn)行標本預處理，單靠選用改良的抗體，同樣可以提高試驗的靈敏度。

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