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2.1 產(chǎn)脂肪酶天然菌株的篩選
經(jīng)過(guò)初篩、復篩培養，分離出4株活性較高菌株，經(jīng)過(guò)法國梅里埃微生物鑒定儀鑒定，2株為霉菌，1株為適應弱堿性環(huán)境的金黃色葡萄球菌（見(jiàn)圖1A，1B），1株為蠟樣芽孢桿菌。經(jīng)過(guò)富集、初篩、復篩等過(guò)程，用溴甲酚紫平板從富含油脂的土壤中篩選得到產(chǎn)脂肪酶的菌株，大部分酶活力經(jīng)測定后在20 U/mL以?xún)龋ㄒ?jiàn)表2）。并對其中的4株的酶學(xué)特性做了初步研究，4株的作用溫度都較高，在42 ℃左右，一株為產(chǎn)弱堿性脂肪酶，另3株為產(chǎn)弱酸性脂肪酶。
2.2 天然菌基因組提取的優(yōu)化
所提供的三種提取方法提取全基因，提取效果見(jiàn)圖2。泳道1和3試劑盒法、酚-氯仿法所提取DNA電泳條帶清晰，泳道2煮沸法提取DNA電泳條帶幾不可見(jiàn)，表明試劑盒法、酚-氯仿法方法提取的DNA得率較高，煮沸法提取的DNA得率較低。
2.2 脂肪酶基因的克隆與鑒定
不同方法提取細菌基因組后的PCR擴增電泳見(jiàn)圖3泳道1～3，表明泳道1試劑盒法最佳，泳道2酚-氯仿法次之，泳道3煮沸法提取的基因組模板的PCR產(chǎn)物出現拖尾現象，可見(jiàn)該方法導致基因組降解較劇烈，完整目的基因也因此保留較少。圖3泳道4，為質(zhì)粒提取試劑盒提取細菌總質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物，無(wú)任何擴增條帶出現表明該菌脂肪酶基因位于染色體基因上，質(zhì)粒不攜帶脂肪酶基因�？寺」こ叹匦绿崛≈亟M質(zhì)粒，重組質(zhì)粒用NcoI，XhoI雙酶切后得到脂肪酶基因大小約為900 bp，與預期結果一致，見(jiàn)圖4。
2.3 測序結果分析
通過(guò)Blast比對分析，沒(méi)有找到與之完全匹配的序列。測序結果與GenBank注冊號EU310372的序列同源性較高。測序結果表明有10處堿基變異，導致三處氨基酸發(fā)生改變，即56位由纈氨酸變?yōu)榫彼幔?83位由亮氨酸變?yōu)樘K氨酸，287位由組氨酸變?yōu)楣劝滨０罚ㄒ?jiàn)圖5）。
2.4 脂肪酶結構預測分析
運用DNA star 7.1軟件分別對兩個(gè)脂肪酶蛋白的二級結構進(jìn)行分析，比較了各類(lèi)氨基酸數目，螺旋（H=helix）、折疊(E=extend/sheet)、轉角(L=loop)結構的出現的頻率（見(jiàn)表3），雖然有一定的變化，但經(jīng)SPSS 11.0統計學(xué)軟件對兩組酶相應結構類(lèi)型進(jìn)行配對t檢驗統計，無(wú)顯著(zhù)性差異（P >0.05)。圖6中箭頭所示為標準序列（A）與克隆脂肪酶氨基酸序列（B）第56位氨基酸發(fā)生突變位點(diǎn)導致親水性的顯著(zhù)提高，183位及其287位氨基酸突變對親水性的影響不顯著(zhù)。
3 討論
3.1 高產(chǎn)酶菌的篩選及其鑒定
由于含有脂肪酶基因的細菌會(huì )進(jìn)行油脂分解代謝，在高油脂環(huán)境中的細菌相應的脂肪酶基因也會(huì )有較高的活力及其表達量，故我們選取長(cháng)期富含油脂的土壤標本分離細菌，這樣可以最大可能地保證待篩選菌株含我們所需高活力脂肪酶基因。實(shí)際采集中，從餐飲店后方的清洗處的土壤中分離到較多種類(lèi)的細菌，結合微生物學(xué)對細菌形態(tài)描述與菌種鑒定，其中就含有多株產(chǎn)高活力脂肪酶的菌株包括葡萄球菌、芽孢桿菌、假單胞菌、霉菌等。
3.2 脂肪酶基因克隆及酶活力測定
根據GenBank中提交的各類(lèi)脂肪酶基因，設計引物的數量大于分離到的菌株數量，對分離到的菌株進(jìn)行不同引物條件的擴增，提高了獲得脂肪酶基因的可能性，達到預期的目的，得到脂肪酶基因。
在提取微生物基因組中我們開(kāi)始時(shí)采用煮沸法。該法操作簡(jiǎn)便，成本也很低，但是其基因組得率低，經(jīng)PCR擴增后得不到產(chǎn)物，尤其對細胞壁較厚的金黃色葡萄球菌等擴增效果不理想，其原因可能是提取的DNA產(chǎn)物不純，混雜有許多蛋白質(zhì)，導致后續的PCR擴增無(wú)明顯結果。因此，試驗中先后采用了基因組提取試劑盒和酚、氯仿方法提取基因組取得了較好的效果。用基因組提取試劑盒提取的DNA得率及其純度都較高，但是成本較高。酚-氯仿法是試驗中常規的一種提取細胞染色體DNA的方法，成本較低，但是步驟繁瑣，耗時(shí)很長(cháng)，DNA經(jīng)過(guò)多種有機溶劑多次抽提損失較大且易被污染，試劑的有效與否也會(huì )產(chǎn)生影響，而且酚和氯仿都對人體有一定的危害[10]。
3.3 克隆脂肪酶二級結構變化討論
克隆脂肪酶的三處氨基酸突變可能是篩選出含該天然酶細菌活性提高、耐受40 ℃高溫以及在高油脂環(huán)境依舊水解脂肪的重要原因。而克隆的脂肪酶三處突變導致的結果是親水性的顯著(zhù)提高，可能有利于提高該酶對脂肪的水解率。
對產(chǎn)脂肪酶的天然菌的分離過(guò)程由于是在暑期進(jìn)行，土壤中油脂來(lái)源于生活生產(chǎn)的廢棄用油，沉積過(guò)程中油的溫度可高達60 ℃以上，那些不耐高溫且脂肪利用率低的細菌死亡，僅耐高溫且產(chǎn)脂肪酶活力高的菌株得以生存。在這種高溫、高油脂的外界壓力篩選下，微生物的脂肪酶基因極有可能發(fā)生突變以適應周?chē)h(huán)境。
本實(shí)驗從細菌中克隆的脂肪酶基因經(jīng)過(guò)BLAST比對后無(wú)完全相同基因型，極可能是該微生物在高油脂環(huán)境的壓力下，其脂肪酶基因發(fā)生突變導致其脂肪酶活力的提高，以便于更好利用這一營(yíng)養物質(zhì)而能生存下來(lái)。后續的研究中我們將進(jìn)一步在原核表達系統中驗證所分離的脂肪酶基因具有高活力，從而獲得具有較高熱穩定性及其活力的脂肪酶用作各種產(chǎn)品的添加劑及其催化劑。
【參考文獻】
[1]汪小鋒,閆云君. 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物脂肪酶[J].中國生物工程雜志,2009,29(1): 105-110.
[2]肖春玲.微生物脂肪酶的研究與應用[J].微生物學(xué)雜志,1997,17(4):56-59.
[3]談重芳,王雁萍,陳林海,等.微生物脂肪酶在工業(yè)中的應用及研究進(jìn)展[J].食品工業(yè),2006, 07(27):193-195.
[4]王海燕,李富偉,高秀華.脂肪酶的研究進(jìn)展及其在飼料中的應用[J].飼料工業(yè),2008, 8(6):14-17.
[5]王小芬,張艷紅,王俊華,等. 微生物脂肪酶的研究進(jìn)展[J].科技導報,2006,2(24):10-12.
[6]閆云君,舒正玉,楊江科,等. 細菌脂肪酶的結構和功能研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2006,4(25):122-126.
[7]Kim EY, Oh KH, Lee MH, et al. Novel cold-adapted alka-line lipase from an intertidalflat metagenome and proposalfor a new family of bacterial lipases[J].Appl EnvironMicrobiol, 2009, 75(1):257-260.
[8]Mosbah H, Sayari A, Mejdoub H, et al. Biochemical andmolecular characterization of Staphylococcus xylosus lipase[J].Biochim Biophys Acta,2005,1723(1-3):282-291.
[9]董明奇,史巖,姜春雷,等.脂肪酶菌株的篩選及酶學(xué)特性研究[J].四川大學(xué)學(xué)報,2008,45(4):985-990.
[10]夏涵,府偉靈,陳鳴,等.快速提取細菌DNA方法的研究[J]. 現代預防醫學(xué),2005,32 (5):571-573
[11]奧期伯 FM,金斯頓 RE,塞德曼JG,等.馬學(xué)軍,舒越龍,譯.4版.北京:科學(xué)出版社,2005:13-24
[12]楊嘯林,張正國.蛋白質(zhì)分析中生物信息學(xué)的應用[J].醫學(xué)研究通訊,2002,31(9): 26-29.
附：天然高產(chǎn)脂肪酶細菌的分離鑒定及脂肪酶基因的分析（上）-點(diǎn)擊查看
