天然高產(chǎn)脂肪酶細菌的分離鑒定及脂肪酶基因的分析（上）

【摘要】  目的 ：從環(huán)境中分離高產(chǎn)脂肪酶的細菌，并克隆其脂肪酶基因。方法：從天然高油脂含量土壤篩選高產(chǎn)脂肪酶的細菌，鑒定菌種后，設計相應引物PCR擴增脂肪酶基因并進(jìn)行TA克隆，重組載體轉入E.coli DH5α構建工程菌，雙酶切及測序鑒定脂肪酶基因。結果：經(jīng)過(guò)微生物菌種鑒定獲得4株高活力菌，其中一株金葡菌產(chǎn)酶最高，利用PCR技術(shù)成功擴增脂肪酶基因，該基因經(jīng)過(guò)克隆測序及其雙酶切鑒定證實(shí)為新發(fā)現的突變脂肪酶基因，其二級結構與標準基因(EU310372)有較大不同。結論：成功分離一株高產(chǎn)脂肪酶的菌株——金黃色葡萄球菌，克隆的脂肪酶基因為新發(fā)現的突變型。

【關(guān)鍵詞】  脂肪酶基因；PCR；TA克隆

　　Abstract:   Objective: To separate natural bacteria producing high activities lipase from environment，and clone its lipase gene. Methods: High activities lipase producing bacteria was screened from soil which contained plenty of oils and fats. After identifying bacteria，PCR amplified lipase gene which was cloned to pMD18-T Vector. The recombint plasmid was transformed into E. Coli DH5αto build the engineering bacteria. At last，the lipase gene was identified with two restriction endonuclease digesting and sequencing. Results: After identifiying，4 producing high activitie lipases bacteria strains were obtained，one of which was a Staphylococcus aureus producing highest activities lipase，its lipase gene was amplified by PCR，then separated and identified as a new mutant lipase gene by restriction endonuclease digesting and sequencing. standard lipase gene registered on NCBI (EU310372)，The secondary structure of the new mutant lipase gene was more different from standard lipase. Conclusion: A strain of high activities lipase producing bacteria-Staphylococcus aureus is successfully isolated and the cloned lipase gene is a new discovered mutant type.

　　Key words:   lipase gene；PCR；TA cloning

　　脂肪酶是一類(lèi)酯鍵水解酶，廣泛存在于微生物、植物種子及動(dòng)物組織中，能在油水界面上催化脂類(lèi)物質(zhì)分解、合成和酯交換反應。作為重要的工業(yè)用酶，脂肪酶在醫藥、食品、制革、飼料、洗滌、油酯化工等傳統工業(yè)領(lǐng)域有著(zhù)廣泛的應用，如可添加在洗滌劑增加去油脂能力，添加在高脂食物以增加口感，而近年來(lái)其在生物能源、有機合成、藥物手性拆分和工具酶等新領(lǐng)域也展現了良好的應用前景[1]。以上領(lǐng)域應用的脂肪酶，或為天然菌分離或為基因重組來(lái)源，但其微生物來(lái)源脂肪酶應用最廣泛[2-5]。據統計，細菌有28個(gè)屬，放線(xiàn)菌有4個(gè)屬，酵母菌有10個(gè)屬，其他真菌有23個(gè)屬，共計達65個(gè)屬的微生物產(chǎn)脂肪酶。而動(dòng)物脂肪酶、植物脂肪酶由于其作用底物譜窄，體外表達活性、產(chǎn)量低，該類(lèi)基因很少作為基因工程的脂肪酶來(lái)源基因[6-8]。

　　本課題擬通過(guò)從高含油脂的環(huán)境中分離到產(chǎn)高活力脂肪酶的微生物并克隆高活力脂肪酶基因，為后續的獲得工程菌清除高油脂污水、獲得較高活力脂肪酶基因并通過(guò)基因工程獲得高活力、高產(chǎn)量的重組脂肪酶研究打下一定基礎。

　　1  材料和方法

　　1.1  主要試劑 

　　E.coli DH5α由溫州醫學(xué)院浙江省醫學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室提供；限制性?xún)惹忻窷del，Hind III，NcoI，XhoI，pMD-18 T vector，T4連接酶、Tag DNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0）、基因組提取試劑盒，均購自寶生物工程有限公司；橄欖油、聚乙烯醇（PVA）、溴甲酚紫購自上海三愛(ài)思試劑有限公司。

　　1.2  產(chǎn)脂肪酶天然菌株的篩選及鑒定 

　　產(chǎn)脂肪酶細菌主要從自然界中篩選，采集溫州汽車(chē)站，茶山鎮及溫州醫學(xué)院茶山校區周?chē)�的油污豐富的土壤，供分離使用。共采集到土壤樣品14份(包括:河道污泥、餐廳廚房清洗處污泥、菜市場(chǎng)肉案上木屑、修車(chē)店門(mén)前污泥、飲食店油煙機油漬等)。篩選方法是：樣品經(jīng)富集培養、平板初篩(觀(guān)察變色圈大小)，最后經(jīng)搖瓶復篩(測酶活力大小)，具體的配方及操作參照文獻[9]。將分離到的菌株用法國梅里埃微生物鑒定儀鑒定，然后進(jìn)行酶活測定。

　　1.3  天然菌基因組提取的優(yōu)化 

　　運用了試劑盒法、酚-氯仿法、煮沸法三種方法分別提取金黃色葡萄球菌全基因組，并經(jīng)PCR擴增脂肪酶基因[10]，比較三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為后續實(shí)驗提供一定的基礎。

　　1.4  脂肪酶基因的克隆 

　　根據NCBI上公布的一些常見(jiàn)的細菌脂肪酶基因設計了8對通用引物（見(jiàn)表1）。

　　用8對引物分別對分離出的菌株進(jìn)行脂肪酶基因的擴增。PCR反應條件I為：94 ℃預變性5 min，再循環(huán)30次：94 ℃變性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸150 s，最后1個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min，適用于引物3、5、8的擴增。PCR反應條件II為：94 ℃預變性5 min，再循環(huán)30次：94 ℃變性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最后1個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min，適用于引物1、2、4、6、7的擴增。PCR反應體系為50μL體系。PCR產(chǎn)物用經(jīng)試劑盒純化，用T4連接酶于與pMD18-T Vector，16 ℃連接2 h后，轉化感受態(tài)E.coli DH5α細菌，再將少許菌液涂布在含有X-Gal，IPTG，Amp的L-瓊脂平板培養基上培養，進(jìn)行藍白斑篩選驗證試驗。

　　1.5  pMD18-T Vector重組載體鑒定 

　　挑取上步驟中單個(gè)白色菌落擴大培養，提取質(zhì)粒[11]，雙酶切電泳鑒定。同時(shí)將單個(gè)白色菌落的菌液送上海生工測序。

　　1.6  脂肪酶測序分析及二級結構預測分析 

　　運用軟件CodonCode Aligner分析測序結果，SPSS 11.0統計學(xué)軟件對其進(jìn)行統計分析，通過(guò)在線(xiàn)免費軟件PredictProtein分別對人工分離到的金葡菌脂肪酶和NCBI上注冊號EU310372脂肪酶進(jìn)行二級結構預測分析[12]。

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