質(zhì)粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測（下）

二、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（Agarosegelelectroghoresis）是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)電場(chǎng)作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應，此外，在弱堿性條件下，DNA分子帶負電荷，從負極向正極移動(dòng)。根據DNA分子大小、結構及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過(guò)介質(zhì)運動(dòng)而相互分離。借助溴化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結合的作用，利用EB染色，并通過(guò)紫外線(xiàn)激發(fā)即可觀(guān)察被分離DNA片段的位置。

【材料】
      1、瓊脂糖、10×TAE電泳緩沖液（40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTA，PH8.0）
      2、載體緩沖液（0.25%溴酚藍，30%甘油）、溴化乙錠水溶液（10mg/ml）
      3、凝膠槽、電泳儀

【方法】

1、取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，100℃加熱溶解。

2、平衡凝膠槽，放好兩側擋板，調節好梳子與底板的距離（一般高出底板0.5~1mm）。

3、鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至500C左右倒入凝膠槽，膠厚一般為5~8mm。

4、待膠徹底凝固后，去掉兩側擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負極端，DNA由負極向正極移動(dòng)），使液面高出凝膠2~3mm，小心拔出梳子。

5、DNA樣品與載體緩沖液5：1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）。

6、打開(kāi)電源，調節所需電壓，電壓與凝膠的長(cháng)度有關(guān)，一般使用電壓不超過(guò)5v/cm。

7、據指示染料移動(dòng)的位置，確定電泳是否終止（溴酚藍的涌動(dòng)距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間）。

8、電泳完畢關(guān)閉電源。將凝膠放紫外燈下觀(guān)察并拍照。

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