質(zhì)粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測（上）

一、堿變性法提取質(zhì)粒DNA

質(zhì)粒(Plasmid)是細菌染色體外能自身獨立復制的雙股環(huán)狀DNA。帶有遺傳信息，可賦予細菌某些新的表型。將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒 DNA探針技術(shù)及檢測質(zhì)粒的PCR技術(shù)用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學(xué)調查已成為現實(shí)。質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著(zhù)重要的作用。

分離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多,但這些方法基本包括三個(gè)步驟：即細菌的培養和質(zhì)粒DNA的擴增；細菌菌體的裂解;質(zhì)粒DNA的提取與純化。

本實(shí)驗學(xué)習用堿變性方法提取質(zhì)粒DNA 。

【原理】

細菌培養物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后，菌體裂解，可使細菌的質(zhì)粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細胞內釋放出來(lái)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠（EB）染色后，在紫外線(xiàn)燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光。根據熒光的位置，可區分不同的核酸帶。

【材料】

1、菌株E.coliJM109（pUC19），E.coliRRI（pBR322）

2、試劑溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)
      溶液II(0.2NNaOH，1%SDS)用前新配制
      溶液III(5mMKAc溶液，PH4.8)
      TE緩沖液(10mMTris.Hcl,1mMEDTA，PH8.0)
      LB液體培養基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g,Nacl10g，加蒸餾水溶解，用NaOH調PH至7.5，加水至1000ml，15磅高壓滅菌15分鐘。)

【方法】

1、接種細菌于5mlLB液體培養基中，37℃培養過(guò)夜。

2、3000rpm/min,離心15min，棄上清。加入100ul溶液Ⅰ懸起細菌沉淀。

3、加入200ul前新配制的溶液II，顛倒EP管5次混合均勻，置冰浴2min。

4、加入150ul溶液III溫和地混勻，12000rpm/min,離心5min。

5、吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中，加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次，12000rpm/min,離心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP管中，加入二倍體積的冷乙醇，12000rpm/min,離心10min。

6、棄乙醇，干燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸，待電泳檢測。

附：質(zhì)粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測（下）-點(diǎn)擊查看

上一篇：在大腸桿菌中高效表達外源蛋白的策略（八）

下一篇：質(zhì)粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測（下）