在家庭環(huán)境下進(jìn)行組織培養的探討與建議（下）

   二、進(jìn)行組織培養前的準備：

 

    1.培養容器和玻璃儀器的準備：

 

    進(jìn)行培養基的配制首先要準備好培養瓶和配制使用的玻璃儀器。培養瓶一般使用各種果醬瓶，要先用洗潔精浸泡瓶子4~8小時(shí)，再用流水沖洗數次。其他的玻璃儀器同樣需要這樣清潔，直到玻璃壁上不掛水珠而是成為水膜為止。清洗完畢的玻璃容器要倒扣，空去瓶?jì)鹊乃��?

 

    清洗干凈的容器要注意防塵，盡量放置在玻璃柜中。更簡(jiǎn)單的是用干凈的毛巾將容器蓋住。

 

    移液管要用吸球來(lái)清洗，反復用蒸餾水吹吸直到潔凈為止，將移液管放置在一個(gè)長(cháng)筒中，便于使用。一般移液管只能使用一次，即要清洗，所以有多必要準備幾只移液管，建議：10ml/2支，5ml/2支，1ml/5支。

 

    2.培養基的配制：

 

    經(jīng)典的組織培養用培養基是ms配方，其基本上劃分為：大量元素、微量元素、鐵鹽、有機復合物、植物激素、糖和支持物。這些成分的用量都在毫克級，用普通天平是難以稱(chēng)量的，為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們可以按比例放大各成分的用量配制成母液，使用的時(shí)候按一定比例加入即可。

 

    下面我將一種ms培養基的母液配制方案公布如下：

 

    大量元素：硝酸銨66.0克；

 

    硝酸鉀76.0克；

 

    無(wú)水氯化鈣13.3克；

 

    七水硫酸鎂14.8克；

 

    磷酸二氫鉀6.8克。

 

    以上分別溶解后合并定容到1升，每配制1升標準ms培養基取25毫升。

 

    鐵鹽： 七水硫酸亞鐵5.56克；

 

    乙二胺四乙酸二鈉（edtana）7.46克。

 

    以上兩種分別加熱溶解，混合，定容到1升，調整ph到5.5以下，每配制一升ms取5毫升。

 

    微量元素和有機復合物的用量過(guò)于微小，為了簡(jiǎn)便我們可以用蔬菜提取液或者馬鈴薯提取液代替。通常我們習慣用100克菠菜加100ml的水煮沸10分鐘，過(guò)濾留濾液，每配制1升ms培養基加入20~50毫升提取液。同樣也可以使用帶皮馬鈴薯100克加200毫升水煮沸15分鐘，過(guò)濾留濾液，每升ms加入50~100毫升即可。

 

    加入上述各組分后，每升ms培養基還需要加入白砂糖30克，瓊脂7克。這里要說(shuō)明的是，糖和瓊脂都是可變的量，要根據需要調整。另外制作果凍用的卡拉膠也可以代替瓊脂，透明度更好。

 

    上述各成分加入后，定容到800毫升左右，用微波爐加熱，直到瓊脂全部溶解為止。此時(shí)加入所需的植物激素（通常配制成0.1%溶液，這樣每取1毫升，換算到培養基中就是1ppm）。然后加水定容到1100毫升（1.1升），之所以多出0.1升是為了抵消分裝和消毒中的損耗。最后用酸堿調整ph到5.8~6.0。

 

    3.使用ms原粉配制培養基：

 

    目前國內的一些化學(xué)品公司開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)便的ms培養基原粉，大大簡(jiǎn)便了培養基的配制，根據不同公司的說(shuō)明選擇培養基的種類(lèi)。下面就以泛生化學(xué)品公司的ms原粉為例：泛生化學(xué)品公司生產(chǎn)的ms培養基原粉，包括了大量元素、微量元素、鐵鹽、有機復合物、糖和支持物，他們的支持物是一種人工合成的半乳糖硫酸脂——polygal，這種物質(zhì)作為支持物雖然提高了成本，但是無(wú)論是透明度還是強度都優(yōu)于瓊脂，更重要的是ploygal對組織的褐變有一定的抑制作用，對初學(xué)者尤為重要。一般稱(chēng)取ms原粉40克，加水800毫升，微波爐加熱溶解，加入激素，定容到1100毫升（1.1升），調整ph值到5.8~6.0。

 

    值得指出的是polygal還有一個(gè)特點(diǎn)，他對ph和滅菌時(shí)間的敏感性很強，如果培養基配制和滅菌出現問(wèn)題，他會(huì )變色來(lái)提醒實(shí)驗者培養基出現問(wèn)題，這個(gè)也對初學(xué)者有一定的幫助。泛生公司也提供純品polygal 供研究使用。

 

    泛生公司的ms原粉價(jià)格大約是50元1000克，能制備20升ms培養基。這對于家庭做組培的愛(ài)好者來(lái)說(shuō)，花50元錢(qián)可以使用一兩年。

 

    4.分裝：

 

    將配制好的培養基分裝在培養容器中，注意要趁熱分裝，因為瓊脂在40度以下就會(huì )凝固。每個(gè)培養瓶裝培養基大約是瓶容積的1/6~1/5，注意不要將培養基掛在瓶的外壁，這樣容易造成污染。分裝后用聚丙烯薄膜或著(zhù)方便面的袋子封口，用膠圈固定（膠圈盡量選擇自行車(chē)的內胎，這種膠圈比較耐熱）。

 

    5. 滅菌：

 

    采用家庭壓力鍋消毒，建議到醫療器械用品商店買(mǎi)一些“滅菌效果試紙”，它們可以指示滅菌效果，當滅菌達到效果時(shí)會(huì )變色。把試紙和培養基同時(shí)放入鍋內，加熱到有大量蒸汽冒出，再加上壓力伐，維持小火30~40分鐘。

 

    滅菌完畢后自然冷卻，將培養基取出，放在陰涼無(wú)塵處備用。

 

    6. 接種箱的準備：

 

    新制作的接種箱必須要清潔干凈，盡量做到無(wú)死角。每次使用前2小時(shí)，將操作所需要的全部物品放入接種箱，再用一個(gè)小燒杯加入3~5克高錳酸鉀放入接種箱內，在箱內向燒杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液，大約幾秒鐘后會(huì )看到甲醛蒸汽出現，這樣可以對接種箱內的所有物品進(jìn)行初次消毒；同時(shí)打開(kāi)紫外線(xiàn)燈照射。紫外線(xiàn)燈是高電壓穿激汞蒸汽產(chǎn)生的，紫外線(xiàn)進(jìn)行第二道滅菌，在紫外線(xiàn)照射大約15分鐘后，會(huì )激發(fā)氧氣形成臭氧，臭氧作為第三道滅菌防線(xiàn)，這樣經(jīng)過(guò)三次滅菌，接種箱基本上可以達到無(wú)菌標準。