幽門(mén)螺桿菌感染的現行臨床診斷檢測技術(shù)（上）

    慢性胃炎和消化性潰瘍是全球性的多發(fā)病。胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,占全球癌癥死亡原因的第二位,我國每年死于胃癌的患者占居惡性腫瘤死亡原因的首位。慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌與幽門(mén)螺桿菌感染密切相關(guān)。幽門(mén)螺桿菌感染是慢性胃炎主要病因(80%_~95%),幽門(mén)螺桿菌感染幾乎無(wú)例外地引起胃粘膜炎癥,感染后機體一般難以自行將其清除,而造成慢性感染。十二指腸潰瘍患者的幽門(mén)螺桿菌感染率為90%_~100%,胃潰瘍?yōu)?span>80%_~90%。幽門(mén)螺桿菌感染與胃癌發(fā)病相關(guān),己被WHO列為I類(lèi)致癌物。在上世紀50年代以前,臨床診斷慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌除依據患者的臨床表現外,主要靠X線(xiàn)鋇餐檢查。慢性胃炎患者用氣鋇雙重造影顯示胃粘膜的微細結構時(shí),萎縮性胃炎可出現胃粘膜皺襞相對平坦、減少；胃竇胃炎X線(xiàn)征表現為胃竇粘膜呈純鋸齒狀及胃竇部痙攣,或幽門(mén)前段持續性向心性狹窄,粘膜粗亂等。消化性潰瘍的X線(xiàn)直接征象為鋇劑填充潰瘍的凹陷部分造成的龕影。胃癌的X線(xiàn)征象主要表現為鋇劑充盈缺損(息肉樣或隆起性病變)、邊緣欠規則或腔內龕影(潰瘍),和胃壁僵直失去蠕動(dòng)(癌侵潤)等。上世紀50年代日本首先發(fā)明內鏡,這種內鏡利用光導纖維原理,不僅可對胃十二指腸粘膜直接觀(guān)察，還可在直視下活檢作病理檢查。

1. 幽門(mén)螺桿菌感染的臨床檢測方法及評價(jià)

幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)是1983年由澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall首次從胃粘膜中分離出的一種螺旋桿菌,它的發(fā)現使人們對慢性胃炎、消化性潰瘍等許多胃腸道疾病的發(fā)病機制及其治療的認識發(fā)生了革命性的變化。目前幽門(mén)螺桿菌的診斷檢測方法包括侵入性和非侵入性?xún)纱箢?lèi)。侵入性方法需通過(guò)內鏡獲取活組織進(jìn)行檢測,非侵入性方法則不需進(jìn)行內鏡檢查。
1.1  侵入性檢測方法
1.1.1  細菌培養:將胃粘膜活檢標本做微需氧環(huán)境下培養,如培養出幽門(mén)螺桿菌即可診斷為幽門(mén)螺桿菌感染。因其特異性高達100%,常被視為幽門(mén)螺桿菌感染診斷的"金標準"�？捎糜隍炞C其它診斷性實(shí)驗,亦可用于藥敏試驗、細菌分型、致病基因的研究等。但它是幽門(mén)螺桿菌診斷試驗中技術(shù)要求最高的一種方法,需要經(jīng)費、時(shí)間和人力均較多,因此限止了其臨床使用,主要用于科學(xué)研究。還應注意,胃粘膜組織中細菌量過(guò)少,細菌繁殖能力差等因素可能會(huì )影響幽門(mén)螺桿菌的培養而導致假陰性。
1.1.2 快速尿素酶試驗(RUT):幽門(mén)螺桿菌產(chǎn)生的尿素酶,可分解尿素產(chǎn)生NH3和CO2,NH3的產(chǎn)生可使pH值升高,胃粘膜組織呈堿性,據此原理可通過(guò)加入pH指示劑通過(guò)顏色的改變判斷有無(wú)幽門(mén)螺桿菌感染存在。目前已有多種尿素酶試劑盒或試紙可供臨床使用,因其操作簡(jiǎn)便、費用低、省時(shí),成為侵入性檢測方法的首選�？焖倌蛩孛冈囼灱河性S多方法的改進(jìn),如應用化學(xué)發(fā)光pH指示劑,使結果出現更快,敏感性提高50倍。在內鏡檢查時(shí)使用幽門(mén)螺桿菌敏感化學(xué)感受檢測器,其敏感性92%、特異性95%,且需時(shí)僅1min。采用定標的快速尿素酶試驗,可測定幽門(mén)螺桿菌定植密度,根據黃、綠、淡藍反應,可對結果進(jìn)行分級,與組織學(xué)方法相比,敏感性和特異性分別為89%和88%^( 1)。
1.1.3 胃粘膜組織切片染色鏡檢:將胃粘膜活檢組織標本固定、脫水后常規石臘包埋、切片染色、鏡下觀(guān)察,根據幽門(mén)螺桿菌的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行檢測和分折,可以直接觀(guān)察胃粘膜表面定植的幽門(mén)螺桿菌。其染色方法有W-S銀染、改良Giemsa染色、甲苯胺藍染色、免疫組化染色等。因染色方法的不同,各有不同的特點(diǎn),其中免疫組化染色是一個(gè)高敏感和特異的染色方法,它是組織學(xué)檢測的"金標準"^( 2)。

1.1.4 胃粘膜直接涂片染色鏡檢:即將胃粘膜組織直接涂于玻璃片,一般用Gram染色后相差顯微鏡下觀(guān)察幽門(mén)螺螺桿菌。Piccolomini等^( 3)]報道了用Leifson鞭毛染色法診斷幽門(mén)螺桿菌感染,用Leifson鞣酸一品紅染色法來(lái)做胃活檢標本印片細菌學(xué)檢查,以顯示幽門(mén)螺桿菌的鞭毛,并與組織學(xué)檢查、快速尿素酶試驗和細菌培養等方法進(jìn)行比較。Leifson染色法15分可完成,其特異性和敏感性與其它檢查方法無(wú)顯著(zhù)性差異(P<0.05)。因比,Leifson染色法具有快速、敏感、可回顧性分析等優(yōu)點(diǎn),是一種非常有用的侵入性試驗方法。

1.1.5 聚合酶鏈反應試驗(PCR檢測技術(shù)):利用與幽門(mén)螺桿菌功能基因分布有關(guān)的核酸片段設計PCR引物或探針,依次進(jìn)行體外基因擴增或雜交,通過(guò)對該菌DNA的測定而診斷有否感染幽門(mén)螺桿菌。目前幽門(mén)螺桿菌的多種基因,如尿素酶(A、B、C、D)基因,16S-rDNA基因,VacA及CagA基因均已克隆成功,根據幽門(mén)螺桿菌不同的耙基因,設計不同的引物,從而建立不同的PCR系統,用來(lái)檢測幽門(mén)螺桿菌都取得了成功。用作PCR的胃粘膜標本應作勻漿處理和/或用特殊緩沖液溶解,以便獲取足夠的DNA。反應混合物中含有耐熱DNA聚合酶、核苷酸、引物以及用來(lái)測定幽門(mén)螺桿菌DNA的胃粘膜標本。在PCR儀上經(jīng)過(guò)30_~40個(gè)擴增循環(huán)后,擴增產(chǎn)物可經(jīng)凝膠電泳分析。如果在電泳中出現與引物相符的DNA帶,可判斷為陽(yáng)性�，F在常用來(lái)識別幽門(mén)螺旋桿菌DNA的引物來(lái)自尿素酶基因(UreA)和16S-rDNA基因。PCR目前主要是用作分子生物學(xué)及分子流行病學(xué)研究,尤其是用于菌株的DNA分型。幽門(mén)螺桿菌基因組DNA203bpPCR產(chǎn)物的單鏈構象多態(tài)(SSCP)也可用于分析和鑒定臨床分離的幽門(mén)螺桿菌菌株。SSCP-PCR不僅可以用于大規模的幽門(mén)螺桿菌流行病學(xué)調查,而且能正確評估根除治療后再現的幽門(mén)螺桿菌是復發(fā)還是再感染。該方法簡(jiǎn)單快速、敏感性強,易于比較。但PCR方法應用于胃活檢組織診斷幽門(mén)螺桿菌感染,與細菌培養和組織學(xué)染色鏡檢比較無(wú)明顯優(yōu)越性�，F在PCR可通過(guò)鼻胃管收集5ml胃液作PCR檢測,敏感性96%,特異性100%⁽⁴⁾。采用膠囊包裹的尼龍線(xiàn)取胃液標本的方法,使這一診斷性試驗的侵入性更小⁽⁵⁾。胃液PCR檢測幽門(mén)螺桿菌敏感性高,但存在引物特異性問(wèn)題,如針對尿素酶基因的引物,可能與口腔和胃內其它尿素酶陽(yáng)性菌叢起交叉反應。

1.2  非侵入性檢測方法
1.2.1  C¹³和C¹⁴尿素呼氣試驗(UBT)  幽門(mén)螺桿菌產(chǎn)生的尿素酶可將內源性或外源性尿素分解成NH3和CO2,后者在小腸上段吸收,進(jìn)入血后隨呼氣排出�？诜�一定量的C¹³和C¹⁴尿素后,通過(guò)高靈敏度質(zhì)譜儀或液閃儀分別測定呼氣中C¹³和C¹⁴的量可判斷有無(wú)幽門(mén)螺桿菌感染。C¹³為穩定同位素,無(wú)放射性,但價(jià)格昂貴；C¹⁴為放射性同位素,輻射量較小,也有較高的安全性,其價(jià)格較廉,但孕婦及兒童仍不宜采用,且大規模使用可能給環(huán)境污染帶來(lái)隱患。尿素呼氣試驗突出的優(yōu)點(diǎn)是: (1) 無(wú)創(chuàng )、方法簡(jiǎn)便,不需要通過(guò)內鏡獲取標本；(2)克服了胃內幽門(mén)螺桿菌"灶性分布"及取材局限的缺點(diǎn),能反映"全胃"情況,并可對胃內幽門(mén)螺桿菌的感染密度作半定量評估。尿素呼氣試驗有較高的敏感性和特異性,但仍受諸如藥物、上消化道出血、胃內其它產(chǎn)生尿素酶細菌等因素影響,可能出現假陰性或假陽(yáng)性。該法還受臨界值高低的影響,因此臨界值的確定非常重要；此外,也受服藥至呼氣收集間隔時(shí)間長(cháng)短的影響,得到被檢者的配合亦很重要,年幼兒童檢測可能會(huì )有困難。呼氣試驗因儀器較貴,限制了它在基層醫院的應用。但從臨床條件出法,可作為根除治療后一種復查方法；有人提出也適合于大規模流行病學(xué)調查,作者認為,見(jiàn)于C¹⁴的放射性及C¹³的昂貴費用,將呼氣試驗用于流行病學(xué)調查顯然是不合適的。

1.2.2  15N尿氨排泄試驗:口服含15N尿素后,利用15N尿素可被幽門(mén)螺桿菌產(chǎn)生的尿素酶分解產(chǎn)生NH3和CO2, NH3經(jīng)吸收在肝臟代謝而經(jīng)尿中排出的原理,通過(guò)色質(zhì)聯(lián)用儀器檢測尿中15N尿氨而判斷有否幽門(mén)螺桿菌感染。該法無(wú)創(chuàng )、無(wú)放射性,敏感性和特異性高,但檢測結果受機體吸收、代謝、排泄等眾多因素干擾,且設備昂貴,臨床應用受到一定限止。
1.2.3  糞便幽門(mén)螺桿菌抗原檢測:由于定居在胃上皮細胞表面的幽門(mén)螺桿菌,隨著(zhù)胃粘膜上皮的快速更新脫落,幽門(mén)螺桿菌也隨之脫落,并通過(guò)胃腸道從糞便排出。幽門(mén)螺桿菌糞便抗原檢測試檢采用酶聯(lián)免疫分析雙抗體夾心法,能夠特異性診斷人體內幽門(mén)螺桿菌感染。資料顯示該方法敏感性96.1%, 特異性98.5%⁽⁶⁾。該方法操簡(jiǎn)便、省時(shí)、不需昴貴儀器,適用于嬰幼兒、兒童幽門(mén)螺桿菌感染的檢測,幽門(mén)螺桿菌根治療效評價(jià),以及幽門(mén)螺桿菌感染的流行病學(xué)調查等^(7,8)。糞便幽門(mén)螺桿菌抗原檢測試檢另一獨特的優(yōu)點(diǎn),如尿素呼氣試驗在有胃部分切除手術(shù)史的患者中準確性有限,此試驗則不受影響；尿素呼氣試驗需被檢者配合,年幼兒童可能會(huì )有困難,而此試檢僅需收集患兒糞便標本�，F在,在美國有兩家公司生產(chǎn)該試劑,其中一家就是我們Ameritek USA,產(chǎn)品稱(chēng)"HpAg"；另一家公司的產(chǎn)品稱(chēng)"HpSA"。

1.2.4  血清及分泌物抗體檢測:幽門(mén)螺桿菌菌體表面存在多種抗原成分,如尿素酶、脂多糖、粘附素等成分,這些抗原均可刺激宿主產(chǎn)生免疫反應,產(chǎn)生IgG、IgA、IgM抗體,傳統的血清學(xué)檢測主要是檢測可長(cháng)期存在于血清中的IgG抗體。常用的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫酶試驗、免疫印跡技術(shù)、膠乳凝集試檢等。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是目前最常選用的定性或定量的檢測幽門(mén)螺桿菌抗體IgG的方法。但由于常選用活體細菌、福爾馬林處理過(guò)的細菌、酸性甘氨酸抽取物等制備物作為抗原,與其它的細菌間可能發(fā)生交叉反應,影響檢測結果。近年來(lái)應用純化尿素酶作為抗原來(lái)檢測抗體,提高了特異性；新型血清抗體的檢測方法,如快速免疫色層法(Flexpact,TMHp)該法是根據反向免疫色層法原理,快速、定性測定血清Hp-IgG抗體,與組織學(xué)檢查對照,其敏感性為94.68%,特異性為89.04%,符合度為92.22%⁽⁹⁾；Hp快速檢測試檢(CIM test),它利用免疫層析技術(shù)檢測全血、血漿或血清中的幽門(mén)螺桿菌特異抗體，該方法敏感性和特異性較高,只需采末稍血用試劑盒檢測,15分便可得到結果。由于幽門(mén)螺桿菌感染數周后才出現特異性抗體,幽門(mén)螺桿菌陰性者血中也可存在交叉反應性抗體(如空腸彎曲菌),且幽門(mén)螺桿菌根除治療后6_~8個(gè)月內甚至幾年可持續在陽(yáng)性水平,故血清學(xué)陽(yáng)性不能完全肯定患者有活動(dòng)性感染,陰性也不能排除初期的感染。因此,血清學(xué)檢測不宜作為現癥感染或根除療效評估的標準,主要用于易感人群的篩查及流行病學(xué)調查。CIM 試劑盒含有一個(gè)基于高度保守的重組抗原,故可以區分現癥感染或既往感染。但該法在根除治療6個(gè)月內仍不能很好的區分現癥或既往感染,目前只可作為篩查初診患者幽門(mén)螺桿菌感染的方法⁽¹⁰⁾。尿液、唾液等分泌物抗體檢測方法,取樣簡(jiǎn)便,無(wú)痛苦,其敏感性、特異性與血清學(xué)試驗相似,結果也可受某些因素影響。
    此外,侵入性診斷方法中的基因檢測和非侵入性診斷方法中的基因芯片及蛋白芯片檢測,都有較高的敏感性和特異性,但因這些方法技術(shù)要求較高,不易普及而多用于科學(xué)研究。
  上述侵入性和非侵入性檢測方法主要針對胃幽門(mén)螺桿菌感染。C¹³和C¹⁴尿素酶呼氣試驗、15N尿氨排泄試驗,對口腔幽門(mén)螺桿菌感染的檢測則成盲點(diǎn),無(wú)法檢出口腔中幽門(mén)螺桿菌的存在。由于口腔中菌群的復雜性及分布不均,可能影響從口腔中培養分離幽門(mén)螺桿菌�？谇粯吮镜�PCR檢測是一種間接的方法,它的敏感性為84%,特異性為82.07%⁽¹¹⁾。糞便幽門(mén)螺桿菌抗原檢測、血清及分泌物抗體測定,既反映胃,也反映口腔幽門(mén)螺桿菌感染。目前尚無(wú)單獨用于口腔幽門(mén)螺桿菌感染理想的檢測方法。

附：幽門(mén)螺桿菌感染的現行臨床診斷檢測技術(shù)（下）-點(diǎn)擊查看

 

上一篇：螺旋桿菌感染對兒童健康帶來(lái)的危害

下一篇：幽門(mén)螺桿菌感染的現行臨床診斷檢測技術(shù)（下）