一、簡(jiǎn)介
在微生物研究中,劃線(xiàn)分離是常見(jiàn)操作,其目的在于將單一的微生物菌株從混合群體中分離出來(lái),或者將細菌在瓊脂平板表面充分地分散開(kāi),使單個(gè)細菌能固定在一點(diǎn)上繁殖,形成單個(gè)菌落,以達到分離純化的目的。
劃線(xiàn)分離具體又有很多方式:三區劃線(xiàn)法、四區劃線(xiàn)法、十六線(xiàn)法、“之”字劃線(xiàn)法等。其中“三區劃線(xiàn)法”是實(shí)驗室最常用的平板劃線(xiàn)接種方法。具體操作如下:將平板分為3個(gè)區域,并分別標記為1、2、3區。首先在1區進(jìn)行劃線(xiàn)操作,起始位置可反復劃線(xiàn),然后“之”字形劃線(xiàn),劃線(xiàn)區域不超過(guò)平板1/3;然后平板旋轉60度,從1區的劃線(xiàn)末端引出1-2條線(xiàn)繼續在2區之字形劃線(xiàn),之后連續劃線(xiàn)不再與1區接觸,以此類(lèi)推,進(jìn)行3區的劃線(xiàn)(如圖1-a),總體來(lái)說(shuō),1區和2區總共約占整個(gè)平板面積的一半,另一半全部作為第3區域,一定要注意,務(wù)必保證當前操作的劃線(xiàn)只能與相鄰前一區域相交,絕不能與其他區域的劃線(xiàn)有重疊。通過(guò)這種方法,能大大提高在2區或3區得到單一微生物菌株的概率;蛘邚1區往2區引線(xiàn)時(shí),只引一條線(xiàn),使這條線(xiàn)盡量與1區的所有線(xiàn)都有接觸(如圖1-b)
圖1 三區劃線(xiàn)的兩種引線(xiàn)方式
二、異常情況
理論上看起來(lái)很簡(jiǎn)單,但在實(shí)際操作中,經(jīng)常會(huì )遇到各種問(wèn)題。最終導致的結果就是劃不出單菌落或者單菌落很少。為什么劃不出單菌落?常見(jiàn)原因如下:
1、菌落生長(cháng)過(guò)密
造成菌落生長(cháng)過(guò)密的原因主要有以下幾個(gè)方面:沒(méi)有充分利于好劃線(xiàn)區域(如圖2-a);各區域線(xiàn)過(guò)于密集,線(xiàn)與線(xiàn)之間重疊(如圖2-b);與前一區交叉過(guò)多(如圖2-a,2-c);或者劃線(xiàn)時(shí)接種環(huán)接觸點(diǎn)變動(dòng),未始終保持接種環(huán)的一點(diǎn)接觸瓊脂表面,造成3區沾附的菌太多。
圖2 菌落生長(cháng)太密,劃不出單菌落的情形
為避免菌落過(guò)密造成劃不出單菌落的問(wèn)題,可以采取以下幾種方法:待接種的細菌菌量過(guò)多時(shí),第1區劃線(xiàn)后務(wù)必灼燒接種環(huán),再進(jìn)行2區劃線(xiàn),2區與3區之間是否需要燒環(huán),根據試驗經(jīng)驗而定。通常來(lái)說(shuō),如果使用菌液進(jìn)行劃線(xiàn),2區和3區是不需要燒環(huán)的,但如果使用菌苔劃線(xiàn),因為接種環(huán)上沾附的菌體很多,只要不是太難生長(cháng)的菌,劃線(xiàn)時(shí)必須燒環(huán),否則很容易長(cháng)得太密,分離不出單菌落(如圖3)。
圖3 挑取菌苔劃線(xiàn)平板時(shí),燒環(huán)不徹底劃出的平板
2、菌落生長(cháng)過(guò)少
造成菌落生長(cháng)太少,無(wú)法長(cháng)出足夠多單菌落的原因主要有以下三點(diǎn):
(1)本身菌種生長(cháng)比較差,不容易培養。
(2)本來(lái)蘸取的菌液比較少,又多次燒環(huán)造成單菌落很少,這種情況通常出現在使用菌液進(jìn)行劃線(xiàn),每個(gè)區都燒環(huán)時(shí)。
(3)在平板劃線(xiàn)過(guò)程中,燒過(guò)的接種環(huán)未充分涼透,接種環(huán)過(guò)熱會(huì )導致細菌死亡,即雖然接種環(huán)沾到了菌體,但是多數都燙死了,從而無(wú)法在平板上生長(cháng)繁殖。因此在劃線(xiàn)過(guò)程中,需要控制接種環(huán)的溫度,避免過(guò)熱。
(4)未掌握好劃線(xiàn)力度與角度,劃破瓊脂,接種環(huán)上沾附的菌體大部分沾附到了劃破的瓊脂中,在后面的劃線(xiàn)過(guò)程中,環(huán)上沾附的菌體很少,甚至接種環(huán)與培養基接觸的部位根本不再有菌,自然劃不出單菌落(如圖4)。
圖4 因劃破瓊脂平板造成單菌落太少的情況
三、好的劃線(xiàn)效果展示
比較理想的三區劃線(xiàn)平板上,菌體生長(cháng)的狀態(tài)應該是:第1區和第2區前部的細菌生長(cháng)成“直線(xiàn)”,第2區后部的細菌生長(cháng)呈“虛線(xiàn)”,第三區呈“虛線(xiàn)”和離散的“小點(diǎn)”(即單菌落)。
本文特挑選幾個(gè)劃線(xiàn)效果較好的平板進(jìn)行展示(如圖5),提供參考。
圖5 分離效果較好的劃線(xiàn)平板
四、注意事項
采用分區劃線(xiàn)法進(jìn)行微生物的接種,為了達到較好的分離效果,要格外注意以下幾點(diǎn):
1. 接種環(huán)的滅菌:在進(jìn)行平板劃線(xiàn)前,需要將接種環(huán)在火焰上灼燒至燒紅,待其冷卻后再進(jìn)行接種操作。不燒環(huán),通常會(huì )造成菌量太多,太密,長(cháng)不成單菌落,如果接種環(huán)灼燒后未冷卻就進(jìn)行劃線(xiàn),可能會(huì )因為溫度過(guò)高殺死菌種,造成下一區接種的菌量太少而無(wú)單菌落生長(cháng)。
2. 劃線(xiàn)技巧:劃線(xiàn)時(shí)要注意角度,保持接種環(huán)的一個(gè)面始終與平板接觸,中間不能換面;要保證劃線(xiàn)不間斷,但又不與劃過(guò)的路線(xiàn)重復或重疊。
3. 防止污染:在進(jìn)行劃線(xiàn)操作時(shí),要注意避免外界污染。例如,在打開(kāi)試管塞、接種環(huán)挑取菌液等操作時(shí),要在火焰旁進(jìn)行。
更加直觀(guān)的劃線(xiàn)手法,可參考視頻:菌株的分離和純化。
總之,平板劃線(xiàn)法雖然非常簡(jiǎn)單,但仍有很多細節需要注意,主要考慮使用的菌種是常規菌還是不易成活的菌,是使用的菌苔還是菌液,具體操作還包括接種環(huán)的滅菌、劃線(xiàn)技巧、防止污染、操作規范等方面。在理論基礎上進(jìn)行反復練習,三分學(xué)七分練才是正道,一定不要十分學(xué),一點(diǎn)都不練,這樣即使學(xué)得再好,也劃不出漂亮的三區。如果沒(méi)有理論指導和規范的樣板,盲目練習,一樣得不出滿(mǎn)意的結果。只要在理論指導下反復練習,每個(gè)人都能成為劃線(xiàn)高手。
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