蠟樣芽孢桿菌檢驗方法及結果判斷

一、蠟樣芽孢桿菌簡(jiǎn)介

  蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，能形成芽孢，屬于需氧芽孢桿菌屬。菌體兩端較平整，芽孢不大于菌體寬度，位于中央或稍偏一端，無(wú)莢膜，有周生表毛，有活動(dòng)能力，能運動(dòng)。本菌生長(cháng)溫度為25℃～37℃，最適溫度為30℃～32℃。在營(yíng)養瓊脂平板上生長(cháng)，菌落乳白色、不透明、邊緣不整齊，菌落邊緣呈擴散狀，近看似白蠟狀。在甘露醇卵磷脂多黏菌素瓊脂平板上，蠟樣芽孢桿菌菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇），環(huán)繞粉紅的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）；在血平板上，菌落周?chē)�呈草綠色β-溶血，周?chē)�透明，菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀；在肉湯中生長(cháng)渾濁，有膜或壁環(huán)，振搖易乳化。本菌能分解麥芽糖、蔗糖、水楊苷和蕈糖，不分解乳糖、甘露醇、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，硫化氫、尿素試驗陰性，卵磷脂酶試驗陽(yáng)性，能在24h內液化明膠，溶血、厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖。

二、參考標準：

  《GB 4789.14-2014 食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》

三、蠟樣芽孢桿菌平板計數法（第一法）

  3.1 檢驗程序

  蠟樣芽孢桿菌平板計數法檢驗程序見(jiàn)圖1。

圖1 蠟樣芽孢桿菌平板計數法檢驗程序

  3.2 操作步驟

  3.2.1 樣品處理

  冷凍樣品應在45℃以下不超過(guò)15min或在2℃～5℃不超過(guò)18h解凍，若不能及時(shí)檢驗，應放于-10℃~-20℃保存；非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時(shí)檢驗，若不能及時(shí)檢驗，應置于2℃～5℃冰箱保存，24h內檢驗。

  3.2.2 樣品制備

  稱(chēng)取樣品25g，放入盛有225mL的PBS或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內，用旋轉刀片式均質(zhì)器以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL的PBS或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL 樣品至盛有225mL PBS或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jì)瓤深A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠）中，振蕩混勻，作為1:10的樣品勻液。

  3.2.3 樣品的稀釋

  吸取3.2.2中1:10的樣品勻液1mL加到裝有9mL PBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成1:100的樣品勻液。跟據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。

  3.2.4 樣品接種

  根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，然后用無(wú)菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

  3.2.5 分離、培養

  3.2.5.1 分離

  在通常情況下，涂布后，將平板靜置10min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱30℃±1℃培養1h，等樣品勻液吸收后翻轉平皿，倒置于培養箱，30℃±1℃培養24h±2h。如果菌落不典型，可繼續培養24h±2h再觀(guān)察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇），周?chē)�有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。培養結果如圖2所示。

圖2 蠟樣芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上的培養結果

  3.2.5.2 純培養

  從每個(gè)平板（符合3.4.1.1要求的平板）中挑取至少5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），分別劃線(xiàn)接種于營(yíng)養瓊脂平板做純培養，30℃±1℃培養24h±2h，進(jìn)行確證實(shí)驗。在營(yíng)養瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展狀，直徑為4mm～10mm。培養結果如圖3所示。

圖3 蠟樣芽孢桿菌在營(yíng)養瓊脂平板上的培養結果

  3.3 確定鑒定

  3.3.1 染色鏡檢

  挑取純培養的單個(gè)菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，大小為（1μm~1.3μm）×（3μm~5μm），芽孢呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長(cháng)鏈狀排列。染色結果如圖4所示。

圖4 蠟樣芽孢桿菌革蘭氏染色結果

  3.3.2 生化鑒定

  3.3.2.1 概述

  挑取純培養的單個(gè)菌落，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗、動(dòng)力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、葡萄糖利用（厭氧）試驗、根狀生長(cháng)試驗、溶血試驗、蛋白質(zhì)毒素結晶試驗。蠟樣芽孢桿菌生化特征與其他芽孢桿菌的區別見(jiàn)表1。

表1 蠟樣芽孢桿菌生化特征與其他芽孢桿菌的區別

  3.3.2.2 動(dòng)力試驗

  用接種針挑取培養物穿刺接種于動(dòng)力培養基中，30°C培養24h。有動(dòng)力的蠟樣芽孢桿菌應沿穿刺線(xiàn)呈擴散生長(cháng)，而蕈狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長(cháng)。也可用懸滴法檢查。培養結果如圖5所示。

圖5 動(dòng)力試驗結果

  3.3.2.3 溶血試驗

  挑取純培養的單個(gè)可疑菌落接種于TSSB瓊脂平板上，30°C±1℃培養24h±2h。蠟樣芽孢桿菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。蘇云金芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌呈現弱的溶血現象，而多數炭疽芽孢桿菌為不溶血，巨大芽孢桿菌為不溶血。培養結果如圖6所示。

圖6 蠟樣芽孢桿菌在TSSB瓊脂平板上的培養結果

  3.3.2.4 根狀生長(cháng)試驗

  挑取單個(gè)可疑菌落按間隔2cm~3cm左右距離劃平行直線(xiàn)于經(jīng)室溫干燥1d~2d的營(yíng)養瓊脂平板上，30°C±1℃培養24h~48h，不能超過(guò)72h。用蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌標準株作為對照進(jìn)行同步試驗。蕈狀芽孢桿菌呈根狀生長(cháng)的特征。蠟樣芽孢桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長(cháng)的特征。結果如圖7所示。

圖7 根狀生長(cháng)試驗結果

  3.3.2.5 溶菌酶耐性試驗

  用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36°C±1°C培養24h。蠟樣芽孢桿菌在本培養基（含0.001%溶菌酶）中能生長(cháng)。如出現陰性反應，應繼續培養24h。巨大芽孢桿菌不生長(cháng)。結果如圖8所示。

圖8 溶菌酶耐性試驗結果

  3.3.2.6 蛋白質(zhì)毒素結晶試驗

  挑取純培養的單個(gè)可疑菌落接種于硫酸錳營(yíng)養瓊脂平板上，30°C±1°C培養24h±2h，并于室溫放置3d~4d，挑取培養物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30s后傾去，再通過(guò)火焰干燥，于載玻片上滴滿(mǎn)0.5%堿性復紅，放火焰上加熱（微見(jiàn)蒸氣，勿使染液沸騰）持續1min~2min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30s，傾去染液用潔凈自來(lái)水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀(guān)察有無(wú)游離芽孢（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結晶體。如發(fā)現游離芽孢形成的不豐富，應再將培養物置室溫2d~3d后進(jìn)行檢查。除蘇云金芽孢桿菌外，其他芽孢桿菌不產(chǎn)生蛋白結晶體。

  3.3.2.7 其他生化鑒定結果結果如圖9和圖10所示。

圖9 過(guò)氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、葡萄糖利用試驗、V-P試驗、甘露醇產(chǎn)酸試驗結果

圖10 酪蛋白分解試驗結果

  3.3.3 生化分型（選做項目）

  根據對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P試驗反應、明膠液化試驗，將蠟樣芽孢桿菌分成不同生化型別，見(jiàn)表2。

表2 蠟樣芽孢桿菌生化分型試驗

圖11 檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗結果

  3.3.4 補充說(shuō)明

  在進(jìn)行蠟樣芽胞桿菌的生化鑒定時(shí)，也可使用蠟樣芽胞桿菌生化鑒定條對其生化反應進(jìn)行判斷，蠟樣芽胞桿菌生化鑒定條中包含了所有蠟樣芽胞桿菌生化鑒定所需培養基，方便快捷高效。鑒定條結果如圖12所示，“+”表示實(shí)驗結果力陽(yáng)性，“-”表示實(shí)驗結果為陰性。

圖12 蠟樣芽胞桿菌生化鑒定條結果

  3.4 結果計算

  3.4.1 典型菌落計數和確認

  3.4.1.1 選擇有典型蠟樣芽孢桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數合計在20CFU~200CFU之間的平板，計數典型菌落數。如果出現a）~f）現象按3.4.2.1中公式（1）計算，如果出現g）現象則按3.4.2.2中公式（2）計算；

  a）只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數在20CFU~200CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

  b）2個(gè)連續稀釋度的平板菌落數均在20CFU~200CFU之間，但只有一個(gè)稀釋度的平板有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

  c）所有稀釋度的平板菌落數均小于20CFU且有典型菌落，應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；

  d）某一稀釋度的平板菌落數大于200CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

  e）所有稀釋度的平板菌落數均大于200CFU且有典型菌落，應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；

  f）所有稀釋度的平板菌落數均不在20CFU~200CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20CFU或大于200CFU時(shí)，應計數最接近20CFU或200CFU的稀釋度平板上的典型菌落。

  g）2個(gè)連續稀釋度的平板菌落數均在20CFU~200CFU之間且均有典型菌落。

  3.4.1.2 從每個(gè)平板中至少挑取5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），劃線(xiàn)接種于營(yíng)養瓊脂平板做純培養，30°C±1℃培養24h±2h。

  3.4.2 計算公式

  3.4.2.1 菌落計算公式（1）

  式中：

  T——樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數；

  A——某一稀釋度蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數；

  B——鑒定結果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數；

  C——用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數；

  d——稀釋因子。

  3.4.2.2 菌落計算公式（2）

  式中：

  T——樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數；

  A₁——第一稀釋度（低稀釋倍數）蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數；

  A₂——第二稀釋度（高稀釋倍數）蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數；

  B₁——第一稀釋度（低稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數；

  B₂——第二稀釋度（高稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數；

  C₁——第一稀釋度（低稀釋倍數）用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數；

  C₂——第二稀釋度（高稀釋倍數）用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數；

  1.1——計算系數（如果第二稀釋度蠟樣芽孢桿菌鑒定結果為0，計算系數采用1）；

  d——稀釋因子（第一稀釋度）。

  3.5 結果與報告

  3.5.1 根據MYP平板上蠟樣芽孢桿菌的典型菌落數，按3.4中公式（1）、公式（2）計算，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽孢桿菌菌數，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。

  3.5.2 必要時(shí)報告蠟樣芽孢桿菌生化分型結果。

四、蠟樣芽孢桿菌MPN計數法（第二法）

  4.1 檢驗程序

  蠟樣芽孢桿菌MPN計數法檢驗程序見(jiàn)圖13。

圖13 蠟樣芽孢桿菌MPN計數法檢驗程序

  4.2 操作步驟

  4.2.1 樣品處理

  同3.2.1。

  4.2.2 樣品制備

  同3.2.2。

  4.2.3 樣品的稀釋

  同3.2.3。

  4.2.4 樣品接種

  取3個(gè)適宜連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），接種于10mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯中，每一稀釋度接種3管，每管接種1mL（如果接種量需要超過(guò)1mL，則用雙料胰酪胨大豆多黏菌素肉湯）。于30°C±1℃培養48h±2h。培養結果如圖14所示。

圖14 胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養結果

  4.2.5 培養

  用接種環(huán)從各管中分別移取1環(huán)，劃線(xiàn)接種到MYP瓊脂平板上，30°C±1°C培養24h±2h。如果菌落不典型，可繼續培養24h±2h再觀(guān)察。

  4.2.6 確定鑒定

  從每個(gè)平板選取5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），劃線(xiàn)接種于營(yíng)養瓊脂平板做純培養，30°C±1°C培養24h±2h，進(jìn)行確證實(shí)驗，見(jiàn)3.3。

  4.3 結果與報告

  根據證實(shí)為蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性的試管管數，查MPN檢索表（見(jiàn)附錄B），報告每g（mL）樣品中蠟樣芽孢桿菌的最可能數，以MPN/g（mL）表示。

相關(guān)標準：

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