空腸彎曲菌檢驗方法及結果判斷

一、空腸彎曲菌簡(jiǎn)介

  空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是彎曲菌屬中的一個(gè)亞種，是引起急性腹瀉的重要病原菌，許多國家報道，本菌從腹瀉病例的分離率為5%～14%，從無(wú)癥狀人群的糞便標本中分離率小于1%，目前已證明為人畜共患病菌。

  本菌為革蘭氏陰性菌，多形態(tài)，螺旋性，彎曲桿狀，有一個(gè)以上的螺旋并可長(cháng)達8μm，也可出現S形或似飛翔的海鷗形；菌體一端或兩端有單根鞭毛，長(cháng)度約為菌體的2～3倍，有活潑的動(dòng)力或不產(chǎn)生動(dòng)力；超過(guò)48h的培養物以衰老的球菌狀居多。

  本菌屬于微需氧菌，初次分離時(shí)需在含5%氧、85%氮和10%二氧化碳環(huán)境中，傳代后能在10%二氧化碳環(huán)境中生長(cháng)，在多氧和絕對無(wú)氧的環(huán)境中均不生長(cháng)。培養適宜溫度為25℃～43℃，培養最適溫度為42℃，最適pH值7.2。對糖類(lèi)既不發(fā)酵也不氧化，呼吸代謝無(wú)酸性或中性產(chǎn)物，生長(cháng)不需血清，從氨基酸或三酸循環(huán)獲得能量。

在布氏肉湯中生長(cháng)呈均勻渾濁。在血瓊脂上，初次分離出現兩種菌落特征：第一型菌落不溶血、灰色、扁平、濕潤、有光澤，看上去像水滴，邊緣不規則，常沿劃線(xiàn)蔓延生長(cháng)；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的單個(gè)菌落（直徑1nm～2nm）邊緣整齊、半透明、有光澤、中心稍渾，呈單個(gè)菌落生長(cháng)。

  在國內外標準（包括美國FDA、ISO、GB等標準）中，食品中空腸彎曲菌的檢驗通常是用Bolton肉湯進(jìn)行選擇性增菌培養，然后利用改良CCD瓊脂和Skirrow血瓊脂進(jìn)行選擇性分離，最后進(jìn)行生化鑒定。

二、參考標準

  《GB 4789.9-2014食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 空腸彎曲菌檢驗》點(diǎn)擊下載

三、檢驗程序

  空腸彎曲菌檢驗程序見(jiàn)圖1。

圖1 空腸彎曲菌檢驗程序

四、檢驗方法及結果判斷

  4.1 樣品處理

  4.1.1 一般樣品

  取25g（mL）樣品（水果、蔬菜、水產(chǎn)品為50g）加入盛有225mL的Bolton肉湯的有濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中（若為無(wú)濾網(wǎng)均質(zhì)袋可使用無(wú)菌紗布過(guò)濾），用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min～2min，經(jīng)濾網(wǎng)或無(wú)菌紗布過(guò)濾，將濾過(guò)液進(jìn)行培養。

  4.1.2 整禽等樣品

  用200mL的0.1%的蛋白胨水中充分沖洗樣品的內外部，并振蕩2min～3min，經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾至250mL離心管中，16000g離心15min后棄去上清，用10mL的0.1%蛋白胨水懸浮沉淀，吸取3mL于100mL的Bolton肉湯中進(jìn)行培養。

  4.1.3 貝類(lèi)

  取至少12個(gè)帶殼樣品，除去外殼后將所有內容物放到均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min～2min，取25g樣品至225mL的Bolton肉湯中（1:10稀釋?zhuān)�，充分震蕩后再轉移25mL于225mL的Bolton肉湯中（1:100稀釋?zhuān)�，�?:10和1:100稀釋的Bolton肉湯同時(shí)進(jìn)行培養。

  4.1.4 蛋黃液或蛋漿

  取25g（mL）樣品于125mL的Bolton肉湯中并混勻（1:6稀釋?zhuān)�，再轉移25mL于100mL的Bolton肉湯中并混勻（1:30稀釋?zhuān)�，同時(shí)將1:6和1:30稀釋的Bolton肉湯進(jìn)行培養。

  4.1.5 鮮乳、冰淇淋、奶酪等

  若為液體乳制品取50g；若為固體乳制品取50g加入盛有50mL的0.1%蛋白胨水的有濾網(wǎng)均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)15s～30s，保留過(guò)濾液。必要時(shí)調整pH值至7.5±0.2，將液體乳制品或濾過(guò)液以20000g離心30min后棄去上清，用10mL的Bolton肉湯懸浮沉淀（盡量避免帶入油層），再轉移至90mL的Bolton肉湯進(jìn)行培養。

  4.1.6 需表面涂拭檢測的樣品

  無(wú)菌棉簽擦拭檢測樣品的表面（面積至少100cm²以上），將棉簽頭剪落到100mL的Bolton肉湯中進(jìn)行培養。

  4.1.7 水樣

  將4L的水（對于氯處理的水，在過(guò)濾前每升水中加入5mL 1mol/L硫代硫酸鈉溶液）經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，把濾膜浸沒(méi)在100mL的Bolton肉湯中進(jìn)行培養。

  4.2 預增菌與增菌

  在微需氧條件下，36℃±1℃培養4h，如條件允許配以100r/min的速度進(jìn)行振蕩。必要時(shí)測定增菌液的pH值并調整至7.4±0.2，42℃±1℃繼續培養24h～48h。培養結果如圖2所示。

  Bolton肉湯原理：乳白蛋白水解物、動(dòng)物組織酶解物提供碳、氮源；酵母浸膏提供各種維生素；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉和偏亞硫酸氫鈉能中和培養基的有毒物質(zhì)，也能增強培養基的空氣耐受力；α-酮戊二酸提供生長(cháng)因子，促進(jìn)空腸彎曲菌的生長(cháng)；碳酸鈉提供空腸彎曲菌最有利的酸堿環(huán)境；頭孢哌酮和多粘菌素B抑制革蘭氏陰性菌的生長(cháng)；萬(wàn)古霉素和三甲氧芐嘧啶抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)；兩性霉素B抑制酵母和真菌的生長(cháng)。

  Bolton肉湯用法：稱(chēng)取基礎培養基27.6g，加入蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min。待Bolton肉湯基礎冷卻至45℃左右，在無(wú)菌條件下，每100mL基礎培養基加入5mL無(wú)菌裂解脫纖維羊或馬血和1支Bolton肉湯添加劑，混勻，備用。

  注：培養基高壓滅菌后有一些小黑色顆粒。

圖2 Bolton肉湯增菌培養結果

  4.3 分離

  將24h增菌液、48h增菌液及對應的1:50稀釋液分別劃線(xiàn)接種于Skirrow血瓊脂與mCCDA平板上，微需氧條件下42℃±1℃培養24h～48h。培養結果分別如圖4、圖3所示。另外可選擇使用空腸彎曲菌顯色平板作為補充。

  觀(guān)察24h培養與48h培養的瓊脂平板上的菌落形態(tài)，mCCDA平板上的可疑菌落通常為淡灰色，有金屬光澤、潮濕、扁平，呈擴散生長(cháng)的傾向。Skirrow血瓊脂平板上的第一型可疑菌落為灰色、扁平、濕潤有光澤，呈沿接種線(xiàn)向外擴散的傾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的單個(gè)菌落，邊緣整齊、發(fā)亮。

  空腸彎曲菌顯色培養基上的可疑菌落按照說(shuō)明進(jìn)行判定。

  mCCDA原理：肉浸液、動(dòng)物組織酶解物、酪蛋白酶解物提供碳、氮源，維生素，生長(cháng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；木炭具有解毒、收集二氧化碳和改變表面張力的作用；去氧膽酸鈉為選擇性抑菌劑；頭孢哌酮可抑制普通腸道菌生長(cháng)，兩性霉素B抑制酵母和真菌生長(cháng)，利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌的生長(cháng)。硫酸亞鐵和丙酮酸鈉有利于空腸彎曲菌的生長(cháng)；瓊脂是培養基的凝固劑。

  mCCDA用法：稱(chēng)取本品51.5g，加入1L蒸餾水或去離子水中，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，每瓶200mL，121℃高壓滅菌15min。待基礎培養基的冷卻至45℃左右時(shí)，加入1支改良CCD瓊脂添加劑（含頭孢哌酮6.4mg、兩性霉素B2mg和利福平2mg），混勻，傾入無(wú)菌平皿，備用。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

  Skirrow瓊脂原理：蛋白陳、胰蛋白陳、酵母浸膏提供碳、氮源，維生素，生長(cháng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸亞鐵有利于彎曲菌的生長(cháng)。頭孢哌酮可抑制革蘭氏陰性細菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)；兩性霉素B抑制真菌生長(cháng)；利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌；瓊脂是培養基的凝固劑。

  Skirrow用法：稱(chēng)取基礎培養基42.5g，加入蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min。待基礎培養基的冷卻至45℃左右時(shí)，加入1mL過(guò)濾除菌的FBP溶液、1支改良Skirrow氏瓊脂基礎添加劑和無(wú)菌凍溶脫纖維羊血5mL，混勻，傾入無(wú)菌平皿。預先制備的平板未干燥時(shí)在室溫放置不得超過(guò)4天或在4℃左右冷藏不得超過(guò)7天。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖4 Skirrow瓊脂培養結果

  4.4 鑒定

  4.4.1 彎曲菌屬的鑒定

  4.4.1.1 概述

  挑取5個(gè)（如少于5個(gè)則全部挑�。┗蚋�多的可疑菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下42℃±1℃培養24h～48h，生長(cháng)情況如圖5所示。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖5 哥倫比亞血瓊脂平板微需氧條件下42℃±1℃培養結果

  按照4.4.1.1～4.4.1.5進(jìn)行鑒定，結果符合表1的可疑菌落確定為彎曲菌屬。

表1 彎曲菌屬的鑒定

  4.4.1.2 形態(tài)觀(guān)察

  挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。結果如圖6所示。

圖6 革蘭氏染色鏡檢結果

  4.4.1.3 動(dòng)力觀(guān)察

  挑取可疑菌落用1mL布氏肉湯懸浮，用相差顯微鏡觀(guān)察運動(dòng)狀態(tài)。

  4.4.1.4 氧化酶試驗

  用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上，如果在10s內出現紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽(yáng)性。結果如圖7所示。

圖7 氧化酶試驗結果

  4.4.1.5 微需氧條件下25℃±1℃生長(cháng)試驗

  挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下25℃±1℃培養44h±4h，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況�？漳c彎曲菌在該培養條件下不生長(cháng)，培養結果如圖8所示。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

  4.4.1.6 有氧條件下42℃±1℃生長(cháng)試驗

  挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，有氧條件下42℃±1℃培養44h±4h，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況�？漳c彎曲菌在該培養條件下不生長(cháng)，培養結果如圖9所示。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖9 哥倫比亞血瓊脂平板有氧條件下42℃±1℃培養結果

  4.4.2 空腸彎曲菌的鑒定

  4.4.2.1 過(guò)氧化氫酶試驗

  挑取菌落，加到干凈玻片上的3%過(guò)氧化氫溶液中，如果在30s內出現氣泡則判定結果為陽(yáng)性。結果如圖10所示。

大腸埃希氏菌 ATCC 25922	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖10 過(guò)氧化氫酶試驗結果

  4.4.2.2 馬尿酸鈉水解試驗

  挑取菌落，加到盛有0.4mL的1%馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液�；旌暇鶆蚝笤�36℃±1℃水浴中溫育2h或36℃±1℃培養箱中溫育4h。沿著(zhù)試管壁緩緩加入0.2mL的茚三酮溶液，不要振蕩，在36℃±1℃的水浴或培養箱中再溫育10min后判讀結果。若出現深紫色則為陽(yáng)性；若出現淡紫色或沒(méi)有顏色變化則為陰性。結果如圖11所示。

圖11 馬尿酸鈉水解試驗結果

  4.4.2.3 吲哚乙酸酯水解試驗

  挑取菌落至吲哚乙酸酯紙片上，再滴加一滴滅菌水。如果吲哚乙酸酯水解，則在5min～10min內出現深藍色；若無(wú)顏色變化則表示沒(méi)有發(fā)生水解。不同細菌在吲哚醋酸酯紙片上的生化反應現象如圖12所示。

圖12 吲哚乙酸酯水解試驗結果

  空腸彎曲菌的鑒定結果見(jiàn)表2。

表2 空腸彎曲菌的鑒定特征

  4.4.2.4 替代試驗

  對于確定為彎曲菌屬的菌落，可使用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡代替4.4.2.1~4.4.2.3進(jìn)行鑒定。

  4.5 結果報告

  綜合以上試驗結果，報告檢樣單位中檢出或未檢出空腸彎曲菌。

相關(guān)標準：

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