專(zhuān)性厭氧菌的培養方法及注意事項

一、專(zhuān)性厭氧菌的介紹

  根據細菌生長(cháng)對氧的需求，主要可分為四大類(lèi)：專(zhuān)性需氧菌、兼性厭氧菌、專(zhuān)性厭氧菌、微需氧菌。

  專(zhuān)性厭氧菌需要在嚴格無(wú)氧的氣體環(huán)境中生長(cháng)，氧氣會(huì )對菌產(chǎn)生毒害作用，也有一些厭氧菌在含5%-10%二氧化碳氣體環(huán)境中可耐受低濃度的氧氣。常見(jiàn)的專(zhuān)性厭氧菌有梭菌屬（如產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌、艱難梭菌等）、雙歧桿菌屬（如嬰兒雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌等）、擬桿菌屬、梭桿菌屬、厭氧消化鏈球菌屬等。

二、厭氧培養環(huán)境的構造

  （1）使用厭氧培養箱，通氣培養。一些厭氧培養箱可同時(shí)進(jìn)行接種等微生物操作，并直接進(jìn)行培養，操作方便，成功率高，缺點(diǎn)是多數實(shí)驗室不具備，損耗較大，對于小規模的培養試驗來(lái)說(shuō)，成本較高。

  （2）使用厭氧罐、厭氧盒或厭氧培養袋+厭氧產(chǎn)氣包，可制作小型或中型空間的厭氧環(huán)境，操作方便，不需要任何復雜的專(zhuān)門(mén)設備，可在所有實(shí)驗室中使用，非常適合實(shí)驗室中小規模的試驗操作。

注意事項：培養基必須與厭氧環(huán)境氣體流通，如使用試管、錐形瓶等容器培養，必須確保塞子透氣；培養平皿時(shí)，必須保證平皿的透氣性良好，不能使用封口膜密閉纏繞。

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  （3）液體培養基可采用覆蓋石蠟隔絕氧氣的方法，如皰肉培養基、梭菌增菌培養基等，在培養基配制完成分裝后，在培養基上方覆蓋約0.5-1cm厚度的液體石蠟，再進(jìn)行滅菌處理，可直接進(jìn)行厭氧菌的培養，無(wú)需使用厭氧培養箱或厭氧罐等設備。

  注：在滅菌前覆蓋石蠟，滅菌過(guò)程中培養基中溶解的氧氣會(huì )逸出，冷卻后石蠟會(huì )阻隔空氣中氧氣的進(jìn)入，可以更好的制造厭氧環(huán)境；培養基中也可補加一定量的還原性鐵粉或硫乙醇酸鈉、半胱氨酸等還原性成分，幫助維持厭氧環(huán)境。

  （4）有些培養基可自然的形成厭氧環(huán)境，無(wú)需厭氧培養，如硫乙醇酸鹽流體培養基，靜置過(guò)程會(huì )自發(fā)分層，下層為無(wú)氧環(huán)境，無(wú)需任何厭氧設備，也無(wú)需覆蓋液體石蠟，即可培養厭氧菌。

三、常見(jiàn)厭氧菌的培養基

1.硫乙醇酸鹽流體培養基

  此培養基常用于梭菌的活化及增菌培養，也可對營(yíng)養成分進(jìn)行改良用于一些營(yíng)養要求較高的厭氧菌的培養，此培養基可自然的形成厭氧環(huán)境，無(wú)需厭氧培養，此培養基靜置過(guò)程會(huì )自發(fā)分層，下層為無(wú)氧環(huán)境，無(wú)需任何厭氧設備，也無(wú)需覆蓋液體石蠟，即可培養厭氧菌。

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2.皰肉培養基

  相比較于硫乙醇酸鹽流體培養基，此培養基需覆蓋液體石蠟，用于培養梭菌時(shí)，可以存活更長(cháng)時(shí)間（如生孢梭菌，在硫乙醇酸鹽流體培養基中只能存活數天，而在皰肉培養基中可存活數月以上）。

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3.GAM/改良GAM培養基

  此培養基營(yíng)養非常豐富，適用于絕大多數的厭氧菌培養，特別是用于比較難培養的營(yíng)養苛求型細菌（如擬桿菌屬）。

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4.血平板/CDC厭氧菌瓊脂

  營(yíng)養豐富，適用于絕大多數厭氧菌的培養（梭菌、擬桿菌等均可培養）。

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5.MRS瓊脂/肉湯

  用于雙歧桿菌的培養，制備好的MRS肉湯培養基澄清透明無(wú)沉淀，常用于乳酸菌或雙歧桿菌的活化、增菌及收集菌體。

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四、注意事項

  （1）培養基的制備

  需覆蓋石蠟的液體培養基，應在滅菌前完成分裝并覆蓋液體石蠟；流體培養基或半固體培養基在有氧條件下培養厭氧菌時(shí)，使用前可采用沸水浴或其他除氧方式排出培養基內溶解的氧氣.

  （2）操作過(guò)程

  因氧氣會(huì )對厭氧菌產(chǎn)生毒害作用，因此整個(gè)操作過(guò)程應在專(zhuān)門(mén)的無(wú)氧設備中進(jìn)行。如在正�？諝庵胁僮�，從厭氧菌暴露在空氣中開(kāi)始到放入厭氧環(huán)境中培養結束，整個(gè)過(guò)程應盡可能快速操作，一般不超過(guò)15分鐘，暴露時(shí)間越長(cháng)，厭氧菌越容易死亡。

  （3）培養環(huán)境

  可采用厭氧罐、厭氧培養箱、厭氧產(chǎn)氣包等方式提供厭氧環(huán)境，除了確保氣體環(huán)境無(wú)氧之外，有些厭氧菌通常還需要5%-10%的二氧化碳、氫氣等氣體促進(jìn)生長(cháng)并提高厭氧菌對氧氣的耐受性，更容易培養成功。

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