糞腸球菌檢驗標準操作程序

標準依據：《GB/T 34224-2017 生物產(chǎn)品中功能性微生物檢測》

1 設備和材料

除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下。

1.1 恒溫培養箱和恒溫厭氧培養箱:37℃士1℃。

1.2 冰箱:2℃～5℃。

1.3 天平:感量為0.1g。

1.4 均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋,均質(zhì)杯。

1.5 振蕩器。

1.6 無(wú)菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

1.7 無(wú)菌錐形瓶:容量250mL、500mL。

1.8 無(wú)菌培養皿:直徑90mm。

1.9 顯微鏡:10倍一100倍。

1.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。

2 培養基和試劑

2.1 KF鏈球菌瓊脂培養基。

2.2 腸球菌肉湯。

2.3 無(wú)菌生理鹽水。

2.4 革蘭氏染色液。

2.5 細菌生化鑒定試劑盒。

3 檢驗程序

糞腸球菌的檢驗程序見(jiàn)下圖。

4 操作步驟

4.1 樣品制備

4.1.1 固體和半固體樣品

稱(chēng)取25g樣品，置于225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打lmin～2min制成1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯中,8000r/min～10000r/min均質(zhì)lmin～2min制成1:10的樣品勻液。

4.1.2 液體樣品

應先將其充分搖勻后,以無(wú)菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jì)阮A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠)中,充分振搖﹐制成1:10的樣品勻液。

4.2 樣品稀釋

4.2.1 用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取l:10樣品勻液lmL,沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成l:100的樣品勻液。

4.2.2 另取1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次lml滅菌吸管或吸頭。

4.3 培養

根據對待檢樣品菌含量的估計,選擇2個(gè)～3個(gè)連續的適宜稀釋度﹐每個(gè)稀釋度吸取樣品勻液0.1mL接種于KF鏈球菌瓊脂平板內,使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面,涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后,將平板靜置10 min使接種物完全被培養基吸收。翻轉平皿置于37℃±1℃厭氧培養箱中培養48h±2h。

4.4 菌落計數

4.4.1 選取特征菌落數在30CFU～300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(cháng)的平板計數菌落總數。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數,大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個(gè)稀釋度的菌落數應采用兩個(gè)平板的平均數。

4.4.2 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí),則不宜采用,而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數。

4.4.3 當平板上出現菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(cháng)時(shí),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計數。

4.5 鑒定

4.5.1 菌落挑選和純培養

挑選平板上5個(gè)暗紅色至粉紅色,表面光滑,周邊整齊的菌落分別轉入腸球菌肉湯培養基37℃±1℃恒溫培養箱中培養24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。

4.5.2 形態(tài)學(xué)鑒定

革蘭氏染色,鏡檢。糞腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌,呈球形或橢圓形,直徑0.5u.m～1.0um,成對或短鏈狀排列,無(wú)芽孢。

4.5.3 生化鑒定

使用細菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒別特征參見(jiàn)表B.5。腸球菌屬常見(jiàn)菌種主要鑒定特征見(jiàn)表C.2。

5 結果計算

5.1每個(gè)平板中糞腸球菌的數量

每個(gè)平板中糞腸球菌菌落數的計算見(jiàn)式(1):

  a=b/A×C                ...............（1）

  式中

  a-每塊平板上的糞腸球菌菌落數；

  b-挑取后經(jīng)證實(shí)為糞腸球菌的菌落數；

  A-挑取平板上用于驗證的菌落數；

  C-平板上的所有特征菌落數。

5.2 菌落總數的計算方法

5.2.1 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個(gè)平板中糞腸球菌菌菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每克(毫升)中菌落總數結果。

5.2.2 若有兩個(gè)連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時(shí),按式(2)計算:

  N=∑C/（n₁+0.1n₂）×d       ...............（2）

  式中:

  N-樣品中菌落數;

  ∑C-平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和；

  n₁-第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個(gè)數；

  n₂-第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個(gè)數；

  d-稀釋因子(第一稀釋度)。

6 報告

6.1 結果判定

若樣品菌落符合糞腸球菌形態(tài)學(xué)及生化鑒定的特征，可判定為糞腸球菌。

6.2 結果報告

6.2.1 定性報告

在25g(mL)樣品中檢出或未檢出糞腸球菌。

6.2.2 定量報告

菌落數小于100CFU時(shí)，以整數報告。菌落數大于或等于100CFU時(shí),對第3位數字進(jìn)行修約后，取前2位數字,后面用0代替位數；也可用10的指數形式來(lái)表示,采用兩位有效數字。

  本文節選自《GB/T 34224-2017 生物產(chǎn)品中功能性微生物檢測》。

附：

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