食品中志賀氏菌的檢驗（下）

一、生化實(shí)驗

  1、用已培養的營(yíng)養瓊脂斜面上生長(cháng)的菌苔，進(jìn)行生化實(shí)驗，即β-半乳糖苷酶、尿素、賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、水楊苷分解和七葉苷分解試驗。

  ①β-半乳糖苷酶試驗

  由于某些志賀氏菌可產(chǎn)生-半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰硝基酚，使培養基由無(wú)色變?yōu)辄S色，以此可鑒定部分志賀氏菌，由實(shí)驗可得，除了宋內氏菌和痢疾志賀氏菌1型，鮑氏志賀氏菌13型的β-半乳糖苷酶為陽(yáng)性以外，其余生化試驗志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖1。

該痢疾志賀氏菌菌株編號為CMCC51252，不為痢疾志賀氏菌1型

圖1

  ②尿素試驗

  某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。由于志賀氏菌不能產(chǎn)生尿素酶，因此志賀氏菌屬的培養物皆為陰性，以此來(lái)區分志賀氏菌屬與其他能產(chǎn)生尿素酶的細菌（如，普通變形桿菌）。如圖2。

圖2

  ③賴(lài)氨酸脫羧酶試驗

  具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴(lài)氨酸→尸胺)和二氧化碳，使培養基變堿，使指示劑顯示出來(lái)。由于細菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，在培養初期培養基和對照培養基呈黃色，繼續培養時(shí)，若氨基酸經(jīng)脫羧或水解產(chǎn)生胺類(lèi)則培養基變堿，呈紫色或紫紅色，即為陽(yáng)性反應；如至培養末期培養基如同對照管一如至培養末期培養基如同對照管一樣均呈黃色，則判為陰性反應。由于志賀氏菌屬的細菌不具備氨基酸脫羧酶，因此志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖3。

圖3

  ④鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗

  具有賴(lài)氨酸脫羧酶的細菌，使鳥(niǎo)氨酸脫去羧基，生成腐胺，從而使培養基變堿性并通過(guò)指示劑變色來(lái)觀(guān)察。由于細菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，在培養初期培養基和對照培養基呈黃色，繼續培養時(shí)，若氨基酸經(jīng)脫羧或水解產(chǎn)生胺類(lèi)則培養基變堿，呈紫色或紫紅色，即為陽(yáng)性反應；如至培養末期培養基如同對照管一樣均呈黃色，則判為陰性反應。在志賀氏菌的檢驗中宋內氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌13型的鳥(niǎo)氨酸為陽(yáng)性，其余志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖4。

圖4

  ⑤水楊苷分解試驗

  若細菌可將水楊苷分解為成葡萄糖和水楊醇，則使溶液pH下降，指示劑顏色變黃；若不能發(fā)酵水楊苷，則溶液顏色不變。在志賀菌屬的檢驗中，志賀菌屬的培養物皆為陰性。如圖5。

圖5

  ⑥七葉苷分解

  若細菌可將七葉苷分解為葡萄糖與七葉素，七葉素與培養基中的二價(jià)鐵離子反應，生成黑色的化合物，使培養基變黑(例如：糞腸球菌)。在志賀菌屬的檢驗中，七葉苷分解實(shí)驗志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖6。

圖6

  2、由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似，必要時(shí)還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油試驗。

  ①靛基質(zhì)試驗

  福氏志賀氏菌型細菌可分解色氨酸形成吲哚（靛基質(zhì)）。吲哚和二甲基苯甲醛反應生成玫瑰紅色吲哚環(huán)，以大腸埃希氏菌為例，大腸埃希氏菌在24小時(shí)時(shí)即可呈現陽(yáng)性反應，而福氏志賀氏菌則需要48小時(shí)才出現陽(yáng)性結果，因此福氏志賀氏菌判定為遲緩陽(yáng)性。如圖7。

該實(shí)驗結果為24小時(shí)時(shí)的實(shí)驗結果

圖7

  ②甘露醇試驗

  若細菌能發(fā)酵甘露醇，則產(chǎn)酸使溶液pH下降，指示劑顏色變黃；若不能發(fā)酵甘露醇，則溶液顏色不變。在志賀菌屬的檢驗中，福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內志賀氏菌為甘露醇陽(yáng)性反應，痢疾志賀氏菌為陰性反應，其中福氏4型和6型為常見(jiàn)甘露醇陰性變種。如圖8。

該福氏志賀氏菌不為福氏4型和6型

圖8

  ③棉子糖試驗

  若細菌能發(fā)酵棉子糖，則產(chǎn)酸使溶液pH下降，指示劑顏色變黃；若不能發(fā)酵棉子糖，則溶液顏色不變。在志賀菌屬的檢驗中，福氏志賀氏菌和宋內志賀氏菌為棉子糖陽(yáng)性反應，痢疾志賀氏菌和鮑氏志賀氏菌為陰性反應。如圖9。

圖9

  ④甘油試驗

  若細菌能利用甘油，則產(chǎn)酸使溶液pH下降，指示劑顏色變黃；若不能利用甘油，則溶液顏色不變。在志賀菌屬的檢驗中，痢疾志賀氏菌與鮑氏志賀氏菌為遲緩陽(yáng)性反應，福氏志賀氏菌為陰性反應，宋內志賀氏菌實(shí)試驗結果無(wú)法確認，即有陽(yáng)性反應也有陰性反應，以標準菌株宋內志賀氏菌CNCC（B）51592為例，其生化反應為陽(yáng)性反應，溶液顏色為黃色。培養18小時(shí)時(shí)實(shí)驗結果圖10所示，其中痢疾志賀氏菌為遲緩陽(yáng)性在18小時(shí)時(shí)不能呈現完全陽(yáng)性現象。

圖10

  3、此外，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應不符合的菌株， 即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬。

  在志賀氏菌檢驗的生化實(shí)驗中結果總結如表2所示：

二、附加生化實(shí)驗

  由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實(shí)驗符合志賀氏菌屬生化特性的培養物還需另加葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36℃培養24h～48h)。

  ①葡萄糖銨試驗

  若細菌可利用銨鹽作為唯一氮源，可在此培養基中生長(cháng)良好，并分解葡萄糖產(chǎn)酸，使培養基變黃，呈陽(yáng)性反應；不能利用銨鹽作為唯一氮源的細菌在此培養基中不生長(cháng)，培養基顏色不變，即為陰性反應。在葡萄糖銨的試驗中，志賀菌屬的培養物均為陰性結果。如圖11。

圖11

  ②西蒙氏檸檬酸鹽試驗

  某些細菌可利用銨鹽作為唯一氮源，并同時(shí)利用檸檬酸鹽為唯一碳源以提供能量，進(jìn)行生長(cháng)繁殖。檸檬酸鹽被分解，產(chǎn)生碳酸鹽和碳酸氫鹽，而銨鹽被分解產(chǎn)生氨，故培養基變堿性，通過(guò)指示劑變色反應，得以鑒別。在西蒙氏檸檬酸鹽的試驗中，志賀菌屬的培養物均為陰性。如圖12。

圖12

  ③粘液酸鹽試驗試驗

  若細菌能夠利用粘液酸分解產(chǎn)酸，使指示劑變黃色，反之，培養基不變色。在粘液酸鹽試驗中，若粘液酸鹽測試肉湯實(shí)驗結果為培養基變黃色，粘液酸鹽質(zhì)控肉湯（對照）培養基不變色，則判定該菌的實(shí)驗結果為陽(yáng)性反應。反之，為陰性反應。如圖13。

圖13

  在志賀氏菌檢驗中附加生化實(shí)驗結果總結如表3所示：

三、補充說(shuō)明

  在進(jìn)行志賀氏菌的生化鑒定時(shí)，也可使用志賀氏菌生化鑒定條對其生化反應進(jìn)行判斷，志賀菌生化鑒定條中包含了所有志賀菌生化鑒定所需要的培養基，方便快捷高效。如圖14所示，為宋內志賀氏菌18小時(shí)時(shí)的生化實(shí)驗結果（“+”表示實(shí)驗結果為陽(yáng)性，“-”表示實(shí)驗結果為陰性）：

圖14

四、血清學(xué)鑒定

  1、抗原的準備

  志賀氏菌屬沒(méi)有動(dòng)力，所以沒(méi)有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體（O）抗原。菌體O抗原又可分為型和群的特異性抗原。一般采用 1.2%～1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。

  注意事項：①一些志賀氏菌如果因為K抗原的存在而不出現凝集反應時(shí)，可挑取菌苔于1mL生理鹽水做成濃菌液，100℃煮沸15min～60min去除K抗原后再檢查。②D群志賀氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，與其他志賀氏菌群抗原不存在交叉反應。與腸桿菌科不同，宋內氏志賀氏菌粗糙型菌株不一定會(huì )自凝。宋內氏志賀氏菌沒(méi)有K抗原。

  2、凝集反應

  在玻片上劃出2個(gè)約1cm×2cm的區域，挑取一環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區域上部，在其中一個(gè)區域下部加1滴抗血清，在另一區域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無(wú)菌的接種環(huán)或針?lè )謩e將兩個(gè)區域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1 min，并對著(zhù)黑色背景進(jìn)行觀(guān)察， 如果抗血清中出現凝結成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒(méi)有發(fā)生自凝現象，那么凝集反應為陽(yáng)性。如果生理鹽水中出現凝集，視作為自凝。這時(shí)，應挑取同一培養基上的其他菌落繼續進(jìn)行試驗。如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征，而其血清學(xué)試驗為陰性的話(huà)，則按注1進(jìn)行試驗。

  福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原鑒別見(jiàn)表 4。

五、結果報告

  綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結果，報告樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。

  注：本文依據《GB 4789.5-2012食品安全國家標準 食品微生物檢驗 志賀氏菌檢驗》

  注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

附：食品中志賀氏菌檢驗簡(jiǎn)單介紹（上） 點(diǎn)擊查看

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