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一、樣品處理及增菌
1.樣品的處理
以無(wú)菌操作取樣25g（mL）加入裝有滅菌225mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)容器中，常用均質(zhì)容器有均質(zhì)杯、錐形瓶、均質(zhì)袋。如圖1-1。
a均質(zhì)袋；b錐形瓶
圖1-1均質(zhì)容器
均質(zhì)杯多用于不易溶解的固體樣品均質(zhì)，可將固體樣品切割攪拌均勻；均質(zhì)袋可置于拍擊式均質(zhì)器中均質(zhì)固體，也常用于液體的均質(zhì)；錐形瓶可置于搖床中，常用于液體的均質(zhì)。
2.增菌
均質(zhì)后的樣品置于41.5℃±1℃，厭氧培養16h-20h。厭氧培養可使用厭氧培養箱、厭氧培養盒和厭氧培養袋（如圖1-2-1）等。
a均質(zhì)袋在厭氧袋中培養；b錐形瓶在厭氧袋中培養
圖1-2-1厭氧袋培養
志賀氏菌在志賀氏增菌肉湯中生長(cháng)渾濁，如圖1-2-2所示。
a空白管；b福氏志賀氏菌ATCC12022；
c宋內志賀氏菌ATCC25931；d痢疾志賀氏菌CMCC51252
圖1-2-2
二、志賀氏菌的分離
取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線(xiàn)接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏顯色培養基平板上，于36℃±1℃需氧培養20h-24h。若出現的菌落不典型或菌落較小不易觀(guān)察，則繼續培養至48h再進(jìn)行觀(guān)察。
1.XLD瓊脂平板
志賀氏菌在XLD瓊脂平板上的菌落特征為粉色至無(wú)色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落（如圖2-1所示）。志賀氏菌大多不發(fā)酵木糖、乳糖和蔗糖，可與發(fā)酵此三種糖類(lèi)的細菌（如大腸黃色菌落）區分；志賀氏菌不產(chǎn)硫化氫，可與產(chǎn)硫化氫的細菌（如大部分沙門(mén)等）區分。
a福氏志賀氏菌ATCC12022；b宋內志賀氏菌ATCC25931；c痢疾志賀氏菌CMCC51252
圖2-1志賀氏菌在XLD瓊脂平板上的生長(cháng)情況
2.MAC或志賀顯色培養基
志賀氏菌在MAC瓊脂平板上的菌落特征為微黃色菌落，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落（如圖2-2-1所示）。志賀氏菌大多不發(fā)酵乳糖產(chǎn)堿，故菌落顏色為黃色，可與發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸（菌落顏色為紅色，或有膽鹽沉淀環(huán)）的細菌區分。部分宋內志賀氏菌遲緩發(fā)酵乳糖，若培養時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )產(chǎn)生粉色菌落，混淆結果。
a福氏志賀氏菌ATCC12022；b宋內志賀氏菌ATCC25931；c痢疾志賀氏菌CMCC51252
圖2-2-1志賀氏菌在MAC瓊脂平板上的生長(cháng)情況
志賀氏菌在志賀氏顯色培養基平板上的菌落特征為白色或無(wú)色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落（如圖2-2-2所示），有些宋內志賀氏菌有藍色中心。
a福氏志賀氏菌ATCC12022；b宋內志賀氏菌ATCC25931；c痢疾志賀氏菌CMCC51252
圖2-2-2志賀氏菌在志賀氏顯色培養基平板上的生長(cháng)情況
三、初步生化試驗
自上述選擇性平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂（TSI）、半固體和營(yíng)養瓊脂斜面一管，置于36℃±1℃需氧培養20h-24h。
1.三糖鐵瓊脂
志賀氏菌在三糖鐵瓊脂TSI中：
①斜面產(chǎn)堿呈紅色且底層產(chǎn)酸呈黃色（發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖、蔗糖），如圖3-1-b、c、d；
②不產(chǎn)氣（福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體），可對比圖3-1-e產(chǎn)氣結果進(jìn)行判斷；
③不產(chǎn)硫化氫，可對比3-1-f產(chǎn)硫化氫（可觀(guān)察到黑色）結果進(jìn)行判斷。
a空白管；b福氏志賀氏菌ATCC12022；c宋內志賀氏菌ATCC25931；
d痢疾志賀氏菌CMCC51252；e大腸埃希氏菌ATCC25922；f沙門(mén)氏菌ATCC14028
圖3-1志賀氏菌在TSI瓊脂斜面上的生長(cháng)情況
2.半固體培養基
志賀氏菌在半固體培養基中無(wú)動(dòng)力，如圖3-2-b、c、d所示，3-2-e、f為有動(dòng)力菌株實(shí)驗結果。
a空白管；b福氏志賀氏菌ATCC12022；c宋內志賀氏菌ATCC25931；d痢疾志賀氏菌CMCC51252
e大腸埃希氏菌ATCC25922；f沙門(mén)氏菌ATCC14028
圖3-2志賀氏菌在半固體瓊脂上的生長(cháng)情況
志賀氏菌在半固體培養基中無(wú)動(dòng)力，只沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)；對比之下，大腸埃希氏菌和沙門(mén)氏菌在半固體培養基中有動(dòng)力，在培養基中擴散生長(cháng)，觀(guān)察培養基會(huì )發(fā)現穿刺線(xiàn)周?chē)尸F“混濁”狀態(tài)。
四、后續鑒定
確定符合TSI和半固體培養基中志賀氏菌生化反應結果的可疑菌落，挑取其在已培養的營(yíng)養瓊脂斜面上生長(cháng)的菌苔，進(jìn)行后續生化實(shí)驗和血清學(xué)鑒定。
五、注意事項
1、取檢樣時(shí)應保證無(wú)菌操作，避免引入污染：①取樣工具（藥匙、槍頭等）、均質(zhì)容器無(wú)菌處理；②取樣操作、后續接種操作在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。
2、在選擇均質(zhì)容器時(shí)，除了要考慮均質(zhì)容器的功能性，還要兼顧后續的厭氧培養條件能否實(shí)現。如果配備厭氧培養箱，則可自由選擇均質(zhì)容器；若只能使用厭氧培養盒或厭氧培養袋，則需考慮到均質(zhì)容器的大小等，以確保厭氧增菌能正常進(jìn)行。
3、使用志賀氏增菌肉湯增菌時(shí)，需注意培養溫度為41.5℃±1℃且厭氧培養，主要是因為志賀氏菌在此條件下并在含有低濃度碳水化合物的培養基中生長(cháng)速度超過(guò)大腸菌群，以及志賀氏菌在提高溫度時(shí)對新生霉素相對耐受。
3、TSI培養基要制成高層斜面，便于后續試驗觀(guān)察，高層斜面是指斜面與底層高度約2:3，即底部高約3cm，斜面長(cháng)度2cm。
4、在進(jìn)行半固體瓊脂穿刺試驗時(shí)，接種針不是總能沿穿刺路徑原路返回，導致穿刺路線(xiàn)會(huì )側向擴大。進(jìn)行結果觀(guān)察時(shí)需注意，半固體培養基的陽(yáng)性結果是穿刺線(xiàn)周?chē)呐囵B基會(huì )呈現“混濁”狀態(tài)，即有菌的運動(dòng)和生長(cháng)，不是單純的側向擴增。
5、部分不產(chǎn)硫化氫的沙門(mén)氏菌是志賀氏菌分離鑒定過(guò)程中的干擾菌，其在XLD、MAC和志賀氏顯色培養基上生長(cháng)狀態(tài)類(lèi)似，需繼續進(jìn)行后續實(shí)驗才能將其區分。
注：本文依據《GB 4789.5-2012 食品安全國家標準 食品微生物檢驗 志賀氏菌檢驗》
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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