中國科學(xué)院微生物所于波團隊Trends in Biotechnology綜述丨非常規酵母：有機酸發(fā)酵的優(yōu)良底盤(pán)細胞

  有機酸發(fā)酵菌株耐酸性差，發(fā)酵過(guò)程添加的堿性物質(zhì)導致的廢鹽再處理成本高是有機酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。非常規酵母由于天然具有理想細胞工廠(chǎng)所需的高魯棒性、寬底物利用能力等優(yōu)異特性而逐漸成為有機酸生物制造的核心組成部分。

  中國科學(xué)院微生物研究所的于波研究員團隊在Cell Press細胞出版社期刊Trends in Biotechnology 發(fā)表了題為“Non-conventional yeasts: promising cell factories for organic acid bioproduction”的綜述。該文的通訊作者為王麗敏項目研究員，于波研究員。該文總結和闡述了非常規酵母的環(huán)境適應性特征，以及非常規酵母菌基因組遺傳操作工具的開(kāi)發(fā)。此外，該文還以在工業(yè)上廣泛應用的C3、C4、以及C6有機酸為實(shí)例，系統闡述了非常規酵母在有機酸生產(chǎn)中的進(jìn)展與挑戰。

非常規酵母：新一代有機酸生產(chǎn)優(yōu)良底盤(pán)細胞

  有機酸是在食品、化工、農業(yè)和制藥等行業(yè)具有廣泛應用的平臺化合物， 2021年全球有機酸市場(chǎng)估計為235億美元，預計到2028年其市場(chǎng)規模將達到261億美元。微生物發(fā)酵法已實(shí)現了大規模生產(chǎn)包括乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸等20多種有機酸。目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)有機酸面臨的重大挑戰之一是積累的產(chǎn)物對生產(chǎn)菌株的抑制作用。有機酸工業(yè)化生產(chǎn)的濃度對大多數有機酸工業(yè)生產(chǎn)菌株具有抑制性，中和劑的添加不可避免地增加了有機酸的生產(chǎn)成本，并使下游產(chǎn)品的提取變得復雜。大多數酵母菌具有耐受性強、生長(cháng)繁殖快等優(yōu)點(diǎn)被用作生物基化學(xué)品發(fā)酵的首選微生物之一。非常規酵母（即未在實(shí)驗室規模研究中廣泛使用和/或在工業(yè)規�；�生產(chǎn)中不常用的酵母菌）由于其具有天然的工業(yè)適應性逐漸成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。比如，庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）可以在低pH條件下生成產(chǎn)物，大大降低中和劑的添加，解決了有機酸生產(chǎn)過(guò)程中堿性副產(chǎn)物添加帶來(lái)的下游提取成本高、環(huán)境污染等問(wèn)題（見(jiàn)圖一）。

非常規酵母作為有機酸生產(chǎn)底盤(pán)細胞至關(guān)重要的特性

非常規酵母在特定環(huán)境中經(jīng)過(guò)長(cháng)期的自然進(jìn)化而獲得耐高溫、耐酸等優(yōu)良特性，這些天然的魯棒性使非常規酵母成為了非常有潛力的生物基化學(xué)品生產(chǎn)菌株，是下一代有機酸生產(chǎn)理想的底盤(pán)細胞。

1. 環(huán)境適應性強

有機酸生產(chǎn)需要環(huán)境適應性強的生產(chǎn)菌株，為了實(shí)現這一目標，性狀優(yōu)良的非常規酵母菌株的篩選與獲得至關(guān)重要。高通量的篩選方法，結合適應性進(jìn)化技術(shù)可以提高菌株在脅迫條件下的生長(cháng)性能。迄今為止，學(xué)者們已經(jīng)對少數非常規酵母進(jìn)行了表征，完成了菌株Komagataella phaffii （P. pastoris），Yarrowia lipolytica， Ogataea polymorpha，K. marxianus，以及P. kudriavzevii（Issatchenkia orientalis）的全基因組測序，并開(kāi)發(fā)了基因組編輯工具，以滿(mǎn)足代謝改造的需要。 

2. 非常規酵母耐酸機制

有機酸發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)物有機酸濃度的增加會(huì )導致環(huán)境pH降低，從而造成毒性，破壞細胞內穩態(tài)，影響脂質(zhì)組織和細胞膜。轉運蛋白在調節底物轉入和產(chǎn)物轉出的過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)至關(guān)重要的作用，Zygosaccharomyces bailii中特有的基因ZbYME2賦予該菌具有耐受苯甲酸和山梨酸的能力。非常規酵母細胞膜中高含量的多不飽和脂肪酸（PUFA）有助于增加膜流動(dòng)性，幫助它們適應外部壓力。此外，液泡中的蛋白質(zhì)降解和再循環(huán)已被證明是酵母在己二酸中存活的重要生物過(guò)程（見(jiàn)圖2）。 

非常規酵母基因組編輯的挑戰

大多數非常規酵母不是天然的有機酸生產(chǎn)者，高效的基因組編輯系統的開(kāi)發(fā)對于構建有機酸生產(chǎn)途徑是不可或缺的。非常規酵母有一些遺傳局限性，例如存在控制生產(chǎn)表型的未確定特征的多因子調控，非同源末端連接（NHEJ）和同源末端修復（HR）的DNA修復機制，以及無(wú)法將某些代謝特征轉移到多個(gè)宿主。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了Y. lipolytica，K. phaffii ，K. marxianusa的合成生物學(xué)（SynBio）工具包，提高外援DNA的整合效率。CRISPR/Cas9，CRISPR interference （CRISPRi），CRISPR activation（CRISPRa），以及多基因整合的工具包YaliCMulti和YaliHMulti已經(jīng)在某些非常規酵母菌中開(kāi)發(fā)，但是缺少通用的基因組編輯工具的開(kāi)發(fā)。

非常規酵母生產(chǎn)工業(yè)應用的有機酸代謝工程改造

以非常規酵母為底盤(pán)，通過(guò)代謝工程改造已經(jīng)獲得了生產(chǎn)不同種類(lèi)有機酸的基因工程菌株（見(jiàn)圖3）。

1. C3有機酸（乳酸、3-羥基丙酸）代謝工程改造

微生物發(fā)酵法是乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)方法，通過(guò)阻斷酵母乙醇合成途徑，引入乳酸代謝途徑，已經(jīng)構建了多株L-乳酸或者D-乳酸生產(chǎn)的非常規酵母工程菌。以P. kudriavzevii為出發(fā)菌株，基因工程改造的菌株D-乳酸產(chǎn)量可以達到135-154 g/L。構建的產(chǎn)L-乳酸的P. kudriavzevii基因工程菌株，在無(wú)中和劑的條件下L-乳酸產(chǎn)量達到75 g/L，為乳酸的清潔生產(chǎn)奠定了基礎。3-羥基丙酸（3-HP）的市場(chǎng)規模預計每年將達到100億美元，傳統的微生物生產(chǎn)方法依賴(lài)輔酶B12。Rhodosporidium toruloides、Y. lipolytica 已經(jīng)被代謝改造，利用甘油或者纖維素水解液生產(chǎn)3-HP。

2. C4有機酸（蘋(píng)果酸、琥珀酸、富馬酸）代謝工程改造

蘋(píng)果酸、琥珀酸和富馬酸被美國能源部列為12種最常見(jiàn)的重要平臺化學(xué)品。P. kudriavzevii基因工程菌株可以利用葡萄糖生成199 g/L的L-蘋(píng)果酸，發(fā)酵終pH為3.1。P. kudriavzevii和Y. lipolytica 已經(jīng)被代謝改造利用葡萄糖、甘油、木糖、或者甘蔗汁為原料生產(chǎn)琥珀酸，最高產(chǎn)量達到198 g/L。雖然Aureobasidium pullulans、Candida glabrata、以及Scheffersomyces stipitis被代謝改造在pH 5.5左右生產(chǎn)富馬酸，但是由于酵母來(lái)源的延胡索酸酶對富馬酸低親和性，導致富馬酸產(chǎn)量較低，還需進(jìn)一步優(yōu)化合成途徑。

3. C6有機酸（己二酸、己酸、檸檬酸）代謝工程改造

己二酸是尼龍生產(chǎn)的前體，年市場(chǎng)需求量約為300萬(wàn)噸，其工業(yè)生產(chǎn)方法為化學(xué)合成法。Candida tropicalis和P. occidentalis具有天然的己二酸耐受性，其代謝改造的菌株可以在低pH條件下生產(chǎn)己二酸。己酸是一種線(xiàn)性羧酸，在食品、藥品和化妝品具有廣泛應用，天然的己酸生產(chǎn)菌株為厭氧菌。針對己酸對酵母菌具有較強抑制作用這一問(wèn)題，利用適應性進(jìn)化技術(shù)提高了Y. lipolytica的己酸耐受性，馴化的菌株可以耐受6 g/L己酸。傳統的檸檬酸發(fā)酵存在氧氣消耗量大以及菌絲體聚集等問(wèn)題，Y. lipolytica被代謝改造生產(chǎn)檸檬酸，產(chǎn)量達到200 g/L。

總結與展望

非常規酵母天然的高魯棒性及寬底物利用能力有望成為新一代有機酸生產(chǎn)底盤(pán)細胞，但是仍有幾個(gè)挑戰需要解決：一是有限的非常規酵母基因組背景表征；二是缺少高效的基因組操作工具，特別是多位點(diǎn)整合工具欠缺；三是與有機酸工業(yè)生產(chǎn)菌株相比，大多數非常規酵母的產(chǎn)量和轉化率還需進(jìn)一步提高。除了獨特的特性以外，一些非常規酵母的條件致病性在微生物細胞工廠(chǎng)開(kāi)發(fā)的過(guò)程中也要適當的考慮。

來(lái)源：CellPress細胞科學(xué)

提醒：本文章所有內容均來(lái)源網(wǎng)絡(luò )，僅用于學(xué)習交流，若有侵權內容，請及時(shí)聯(lián)系刪除或修改，特此聲明！

上一篇：文物修復里的科學(xué)密碼：微生物變“文物醫生”

下一篇：沒(méi)有了！