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高分辨熔解曲線(xiàn)(high resolution melt，HRM)分析是2003年美國Utah大學(xué)Wittwer實(shí)驗室提出的一項檢測基因突變的新技術(shù)[1]。該技術(shù)利用DNA鏈中的任何突變、SNP、GC含量的改變及長(cháng)度的變化等都會(huì )影響熔解曲線(xiàn)的Tm值及峰形的原理，在含有飽和熒光染料的體系中進(jìn)行常規PCR反應，隨后在real-time PCR儀中，對產(chǎn)物進(jìn)行升溫變性、采集熒光數據，根據熔解曲線(xiàn)的峰形及Tm值檢測特定的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)，同時(shí)也可以發(fā)現新的SNP。目前HRM分析已廣泛應用于細菌的鑒定、基因分型、重復序列分析、突變掃描及甲基化檢測等多個(gè)領(lǐng)域。隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量高通量測序工作的完成，為HRM突變位點(diǎn)的檢測提供了新的靶點(diǎn)，并促進(jìn)了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。
一、高分辨熔解曲線(xiàn)分析概述
雙鏈DNA隨著(zhù)溫度升高變性形成單鏈DNA，其中50% DNA分子發(fā)生變性的溫度稱(chēng)為熔解溫度(melting temperature，Tm值)。熒光染料與雙鏈DNA結合時(shí)才能夠發(fā)出熒光，當DNA變性形成單鏈時(shí)，熒光染料自DNA鏈上脫落下來(lái)，熒光信號便急劇減弱。以溫度為橫坐標對熒光信號作圖，即可得到熔解曲線(xiàn)。DNA鏈中的任何突變及GC含量的改變都會(huì )影響熔解曲線(xiàn)的Tm值及峰形。
目前HRM分析所用的熒光染料主要是飽和熒光染料，如LC GreenPlus(idaho)等。飽和熒光染料不僅與DNA有更強的結合能力并且對PCR反應無(wú)抑制作用。飽和熒光染料在飽和濃度條件下對DNA雙鏈進(jìn)行標記，在升溫解鏈的過(guò)程中不會(huì )發(fā)生染料分子之間的重排，細微的序列差異即可通過(guò)熒光信號的變化體現出來(lái)。HRM的目的是能夠對單個(gè)堿基差異進(jìn)行區分，因此除了對熒光染料有特殊要求外，其對real-time PCR儀要求也較高。需要PCR儀孔間溫度差異小于0.2 ℃，每步升溫0.02～0.1 ℃，而且每升高1 ℃熒光采集次數大于10次。此外，為了提高HRM檢測的靈敏度和分辨率，相關(guān)儀器還需要高能量的激發(fā)光源以檢測熔解曲線(xiàn)的微小變化。
HRM技術(shù)自2003年被首次提出后，一直向著(zhù)高靈敏(單分子)、高通量和高效率的方向發(fā)展，目前該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用到生物研究的各個(gè)領(lǐng)域中，其中在細菌感染性疾病臨床診斷中的應用主要包括細菌病原體的鑒定及耐藥性的檢測等方面。
二、高分辨熔解曲線(xiàn)分析在臨床細菌快速鑒定中的應用
目前細菌感染性疾病病原學(xué)診斷的金標準仍然為培養的方法。然而傳統的培養方法耗時(shí)較長(cháng)，通常不能滿(mǎn)足臨床診治的需求。16S rRNA基因由于其在細菌進(jìn)化中的保守性，常常作為病原菌鑒定的標準標識序列。以16S rRNA基因作為靶基因進(jìn)行的HMR分析技術(shù)，操作便捷、靈敏度高，且PCR反應后即可得到結果，是分子生物學(xué)技術(shù)應用于臨床菌株診斷的重要進(jìn)展。近兩年來(lái)有多項研究利用PCR-HRM技術(shù)對細菌感染性疾病的病原菌進(jìn)行了快速鑒定。例如，非發(fā)酵革蘭陰性桿菌是囊性纖維化或慢阻肺患者疾病發(fā)生發(fā)展的主要病原，而傳統的細菌培養鑒定方法耗時(shí)較長(cháng)，為了臨床早期治療方案的合理選擇，Navratilova等[2]設計了針對16S rRNA基因4個(gè)區域的引物，建立了PCR-HRMA方法，并用該方法對來(lái)自65例患者臨床樣本純培養的275株菌進(jìn)行了鑒定，結果發(fā)現PCR-HRMA的鑒別能力遠高于傳統的表型的鑒定方法。此外，對于慢生長(cháng)細菌如分枝桿菌，不同種的分枝桿菌所引起的臨床癥狀往往相似但其治療方案相去甚遠，因此分枝桿菌菌種的鑒定對臨床治療至關(guān)重要，而傳統的培養為基礎的鑒定方法難以滿(mǎn)足臨床需求。Issa等[3]用qPCR-HRM分析16S rRNA基因實(shí)現了對8種共18株分枝桿菌的快速鑒定，并為臨床合理用藥提供了可靠的依據。小腸結腸炎耶爾森菌和假結核耶爾森菌感染不僅可以引起急性消化系統炎癥，還可以導致全身系統性感染。這兩種耶爾森菌入血引發(fā)的全身感染，需要選用不同的抗生素進(jìn)行治療。Souza等[4]根據小腸結腸炎耶爾森菌和假結核耶爾森菌16S rRNA基因V3區140 bp片段序列的差異設計引物，利用PCR-HRM方法能夠對這兩種耶爾森菌進(jìn)行鑒定，為臨床抗生素的選擇提供指導。
在感染性疾病致病機制上，同一種病原菌由于其血清型及毒力基因的不同，其致病性及治療方案也可能完全不同。針對菌株特異性序列設計引物，PCR-HRM分析對同一病原菌中不同血清型及毒力的菌株也可以進(jìn)行很好的鑒別。腸道感染致病菌如沙門(mén)菌屬、志賀菌和致病性大腸埃希菌的血清學(xué)分型是臨床診斷和疾病傳播控制的必要技術(shù)，但醫院臨床實(shí)驗室受診斷血清購買(mǎi)渠道和分型類(lèi)別所限，難以滿(mǎn)足需求。PCR-HRM技術(shù)在這一領(lǐng)域得到廣泛應用。如結合SYBR ® Green Real-time PCR和HRM方法對5種主要的腸道致病性大腸埃希菌血清型(O26, O103, O111, O145和O157)進(jìn)行鑒別診斷[5]。Banowary等[6]針對空腸彎曲菌hipO基因和大腸彎曲菌asp基因片段的差異，利用PCR-HRM分析技術(shù)實(shí)現了這兩種彎曲菌的檢測與鑒定，該技術(shù)對臨床樣本鑒定的敏感度和特異度分別是100%和92%。Ohshima等[7]將rarA和ldh基因作為HRM分析的靶基因對9種李斯特菌進(jìn)行鑒定，并與16S rRNA基因測序結果進(jìn)行比較，其一致率為92.6%。而以nuc和Sa442基因為靶點(diǎn)的HRM能夠實(shí)現對金黃色葡萄球菌的分型鑒定[8]。以16S-23S rRNA內部間隔序列為靶標的HRM分析能夠一次反映鑒別12種非結核分枝桿菌[9]。PCR-HRM分析對臨床病原菌快速、準確的鑒定，為感染性疾病的及時(shí)治療提供了極大的幫助。同時(shí)，HRM分析在疫苗研發(fā)方面也顯示出應用前景。如腸道沙門(mén)菌腸炎血清型是人類(lèi)腹瀉的主要病原菌，其主要來(lái)源為污染的禽肉類(lèi)及其制品。為了減少禽類(lèi)的感染，全球多個(gè)國家使用了沙門(mén)菌疫苗菌株。為了區別疫苗菌株與野生毒株，Maurischat等利用非標記探針標記法(Unlabeled Probe High Resolution Melting, UP-HRM)針對腸炎沙門(mén)菌疫苗菌株和野生菌株nhaA和kdpA基因的序列差異設計引物，實(shí)現了兩者間的鑒別[10]。
三、高分辨熔解曲線(xiàn)分析在抗感染藥物敏感性檢測中的應用
抗菌藥物作用靶點(diǎn)基因突變是細菌產(chǎn)生耐藥性的主要機制之一。因此，利用HRM方法檢測與細菌耐藥相關(guān)基因的位點(diǎn)突變，能夠快速準確地判定病原體的耐藥性。Dona等[11]針對淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)菌株基因組特點(diǎn)，使用9對引物對其進(jìn)行HRM分析建立了一種基于SYBGreen的HRM方法，同時(shí)實(shí)現了NG菌株的鑒定及耐藥檢測。該方法通過(guò)對193株臨床菌株的驗證發(fā)現其靈敏性和特異性與培養的方法完全一致。結核病是重要的公共衛生問(wèn)題，HRM技術(shù)在結核分枝桿菌耐藥性檢測中也有較好的應用價(jià)值。結核分枝桿菌的耐藥主要與某些特定基因的突變相關(guān)。如rpoB基因突變與利福平耐藥相關(guān)，gyrA基因突變與喹諾酮類(lèi)耐藥相關(guān)，katG基因與異煙肼耐藥相關(guān)。因此利用HRM技術(shù)檢測特定基因的SNP就可以快速鑒定出結核分枝桿菌的耐藥性。目前已有多項研究使用HRM技術(shù)對臨床常用抗結核藥物(利福平、異煙肼、氧氟沙星、鏈霉素及吡嗪酰胺)進(jìn)行耐藥性檢測[12,13,14,15,16]。其中Galarza等使用HRM的方法檢測秘魯167株結核分枝桿菌臨床菌株中的多耐藥結核分枝桿菌并與藥敏試驗結果相比較，發(fā)現該方法對利福平耐藥的敏感性和特異性分別是98.7%和97.5%，對異煙肼耐藥菌株檢測的敏感度和特異度分別是98.7%和100%[17]。在沙門(mén)菌耐藥性檢測中，HRM通過(guò)檢測沙門(mén)菌gyrase基因的喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(quinolone-resistant determining region，QRDR)和拓撲異構酶Ⅳ基因的突變，能夠快速鑒定出喹諾酮及氟喹諾酮耐藥沙門(mén)菌[18]。此外，HRM技術(shù)也可直接檢測臨床樣本中致病菌的耐藥性，如使用HRM技術(shù)自無(wú)癥狀小學(xué)生鼻咽部檢測紅霉素耐藥百日咳桿菌[19]。
細菌耐藥的遺傳基礎除了染色體介導外，更多的是質(zhì)粒介導的耐藥。如質(zhì)粒介導的AmpCβ-內酰胺酶(pmAmpC)是一種新型C類(lèi)β-內酰胺酶，根據與染色體C類(lèi)酶氨基酸序列的同源性，可分為6類(lèi)(blaMOX、blaFOX、blaCMY-2、blaDHA、blaACC和blaACT)。除了介導細菌對第一、二、三代頭孢菌素、頭霉素、氨曲南的耐藥，pmAmpC甚至能夠使外膜蛋白丟失的菌株出現對碳青霉烯類(lèi)的耐藥。Geyer等人分別針對6類(lèi)pmAmpC基因設計引物，使用HRM技術(shù)對其進(jìn)行檢測，其靈敏性和特異性分別為96%和100%[20]。
HRM技術(shù)在院內感染的監測與鑒定中也有較好的應用。Wong等[21]針對院內感染常見(jiàn)的5種細菌(鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌以及MRSA)其種屬特異性基因區域分別設計引物，在一個(gè)多重PCR反應后，分析其熔解曲線(xiàn)，根據5種細菌PCR產(chǎn)物熔解溫度的不同，實(shí)現對菌株的鑒定。隨后，研究者們用150株臨床菌株對該HRM方法進(jìn)行驗證，其準確性達到100%。此外，HRM的方法還可以直接監測耐藥菌株的傳播。Woksepp等[22]將連接介導PCR(LM/PCR)與HRM聯(lián)用，快速檢測了由ESBL大腸埃希菌引起的院內感染暴發(fā)。HRM在院內感染菌株的快速鑒定及耐藥菌株傳播監測中的應用，能夠有效地提高醫院的醫療質(zhì)量，減少患者不必要的痛苦和經(jīng)濟負擔。
近年，隨著(zhù)交叉學(xué)科的發(fā)展，基于熔解曲線(xiàn)分析的微流控床旁一體化檢測技術(shù)已逐步從研究走向臨床。例如，可檢測呼吸道感染、血流感染、中樞神經(jīng)系統感染和胃腸道感染的多種病原體靶標以及抗生素耐藥基因的FilmArray?系統。該技術(shù)利用巢式二步PCR結合熔解曲線(xiàn)分析，PCR產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)提供了產(chǎn)物特異的"指紋圖譜"，實(shí)現多重、高靈敏度和高特異性檢測。該方法檢測一個(gè)樣本手工操作僅耗時(shí)2 min，運行時(shí)間僅為約1 h，并且在一個(gè)密閉系統中進(jìn)行提取、擴增和檢測，可最大限度減少污染�？焖佾@得的檢測結果所提供的必要信息有助于初級醫護人員和急診室醫生更好地對患者進(jìn)行分診，并及時(shí)制定可靠的醫療決策。
四、展望
HRM自問(wèn)世以來(lái)，在感染性疾病的臨床診斷中得到了廣泛的研究和評估。由于其操作簡(jiǎn)單、結果準確、耗時(shí)短及成本低等優(yōu)點(diǎn)，在國外已經(jīng)廣泛應用于許多實(shí)驗室自建項目的臨床檢測中，基于熔解曲線(xiàn)分析的多重病原菌及耐藥分析一體化床旁檢測商品化系統已經(jīng)面世，為感染性疾病診治帶來(lái)創(chuàng )新性突破。在國內由于尚未開(kāi)放臨床實(shí)驗室自建項目檢測，而價(jià)格高昂的進(jìn)口商品化系統難以普及大眾，目前尚未應用于臨床標本檢測。但HRM技術(shù)在臨床細菌鑒定及藥敏檢測中具有巨大的潛力，在不久的將來(lái)必定會(huì )在細菌感染性疾病的預防與治療中發(fā)揮重要作用。
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