微生物學(xué)診斷

細菌學(xué)診斷

1 ．細菌的形態(tài)鑒定

細菌微小，必須借助于光學(xué)顯微鏡才能看到。細菌從形態(tài)上可分為球狀、桿狀和螺旋狀三種基本類(lèi)型。細菌細胞的基本構造是由細胞壁、胞漿膜、細胞漿、細胞核等部分構成。有的細菌除具有基本構造外，還能形成莢膜、芽胞、鞭毛、柔毛等特殊構造。細菌的形態(tài)、大小及染色是鑒定細菌的重要標志。

( 1 ）不染色標本的制備和檢查：不染色標本主要用于觀(guān)察活體微生物的狀態(tài)和運動(dòng)性，例如壓滴標本。壓滴標本是取潔凈載玻片一張，在其上加一滴生理鹽水（如是液體材料可以不加水），再用接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌后蘸取適量的待檢材料，然后在水滴上加蓋一張潔凈的蓋玻片（注意不可有氣泡）。檢查時(shí)將標本置于顯微鏡載物臺匕先用低倍鏡測定位置，然后用高倍鏡或油鏡觀(guān)察。

( 2 ）染色標本的制備

①抹片標本的制作：對于固體培養物，取一滴蒸餾水或生理鹽水于清潔無(wú)塵玻片一端。左手持菌種管，右手持接種環(huán)于火焰上滅菌，右手小指與無(wú)名指夾住菌種管棉塞并取下，管口迅速通過(guò)火焰滅菌，以滅菌的接種環(huán)自菌種管內挑少許培養物，與蒸餾水棍合，涂布成約直徑為1 厘米的涂片，涂片應薄而均勻。對于液體培養物不必加蒸餾水或生理鹽水直接以無(wú)菌操作采用液體培養物1 一2 環(huán)作涂片即可。對于組織臟器，右手持無(wú)菌鑷子夾住一塊組織（如肝脾），左手用無(wú)菌剪刀剪取所夾組織，右手隨即以新鮮切面在玻片的一端觸及壓印涂片。

涂片最后在室溫中令其自然干燥。冬天氣溫較低或急用時(shí)，可將標本面向上，小心在酒精燈火焰近處略烘，加速水分蒸發(fā)，但勿緊靠火焰以免標本烤枯。

②抹片的固定：手執玻片的一端，即涂有標本的遠端，標本面向上，在火焰包層快速地來(lái)回通過(guò)三次，約3 一4 秒鐘，每次通過(guò)火焰后以手背不燙為宜。待冷后進(jìn)行染色。固定的目的是殺死細菌，使菌體蛋白凝固于玻片上，不至于染色時(shí)被水沖去，便于著(zhù)色。組織觸片不宜用火固定，用化學(xué)法（如甲醇）固定。

( 3 ）染色方法

①單染色法：如亞甲藍染色法，取經(jīng)干燥、固定的涂片滴加亞甲藍染液2 - 3 滴，使染液蓋滿(mǎn)涂片面，1-2 分鐘后吸去染色液，用細小水流沖去多余染液，晾干或用濾紙輕輕吸干。結果是菌體呈藍色，莢膜呈粉紅色。

②復染色法：如革蘭染色法，其操作步驟是取干燥并經(jīng)火焰固定的涂片滴加草西酸錢(qián)結晶紫2 - 3滴于涂面上，染色1 分鐘后水洗，并將玻片L 積水輕輕拭凈。加革蘭碘溶液2- 3 滴于涂片仁媒染1分鐘后，倒去碘液輕輕拭凈，再加95 ％酒精3 一5 滴于涂面L ，頻頻搖晃水溶液（或石炭酸復紅溶液）復染30 秒，水洗后用油鏡觀(guān)察。結果是革蘭陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭陰性菌為紅色。

③女原姆薩染色法：觸片經(jīng)自然干燥后，不用火焰Ib1 定，直接滴加姬姆薩染色液數滴（染液中有甲醇，能起固定作用），經(jīng)2 分鐘后再加等量蒸餾水．輕輕搖晃使之與染液混合均勻。5 分鐘后水洗干燥，或將玻片浸人盛有染色液的缸中，染色數小時(shí)或過(guò)夜，取出水洗、干燥、滴油鏡檢。

④芽胞染色法：取干燥火焰固定的涂片，滴加5 ％孔雀綠水溶液于涂片上，加熱使其產(chǎn)生水蒸氣，以不產(chǎn)生氣泡為佳，約30 一60 秒，水洗30 秒，以石炭酸復紅（或沙黃水溶液）．復染30秒，水洗、吹干鏡檢。菌體呈紅色，芽胞呈綠色。

⑤鞭毛染色法：染色液有甲液（0 . 5 ％苦味酸）l 毫升、乙液( 20 ％靴酸液）l 毫升、丙液（5 ％鉀明礬液）0 . 5 毫升、丁液（11 ％復紅酒精溶液）0 . 15 毫升。各液在使用前，按順序混合好可使用。染色法是取10 一12 小時(shí)的幼齡培育菌，用1 ％福爾馬林液制成菌液，固定24小時(shí)后，于載玻片上涂成薄片。待自然干燥后，用上述染色液加溫染色30 秒至1 分鐘，然后靜置1 一2 分鐘，水洗，干燥，鏡檢。結果菌體呈深紅色，鞭毛為淡紅色。

⑥抗酸染色法：在固定后的涂片上，滴石炭酸一品紅染色液，在載玻片下用火焰加熱至發(fā)生蒸汽但不能產(chǎn)生氣泡，約3 一5 分鐘后用3 ％鹽酸酒精脫色，至無(wú)紅色脫落為止（約1 一3 分鐘），再水洗后，以堿性亞甲藍染液復染1 分鐘。水洗，吸干，鏡檢。結核桿菌和副結核桿菌均為抗酸性細菌，故可以用此染色法和其他細菌相區別。結果是抗酸性菌染成紅色，其他菌為藍色。

⑦負染色法（墨汁襯色法）：于干凈的載玻片卜加1 滴苯胺黑（或優(yōu)質(zhì)繪圖墨汁），用滅菌的接種環(huán)取待檢材料（以純培養或病料）少許，均勻混合于苯胺黑（或墨汁）中，并立即將其涂散，使成薄的涂片，待其干后不用水洗即直接鏡檢，可見(jiàn)在黑色的背景上，出現不著(zhù)色透明菌體，所以稱(chēng)負染色法。結果是螺旋體無(wú)色發(fā)亮，背景呈黑色。

⑧雷別格爾莢膜染色法：涂片、干燥，滴加2 ％一3 ％福爾馬林龍膽紫染液，染色20 一30 分鐘，立即水洗，干燥，鏡檢。結果莢膜呈淡紫色，菌體為深紫色。

⑨螺旋體染色法（剛果紅法）：染色液是2 ％剛果紅水溶液及1 % -2 ％鹽酸酒精液，染色是在載玻片上滴加螺旋體的標本和2 ％剛果紅水溶液各1 滴，混勻，涂成薄片。干燥后滴加1 % - 2 %鹽酸酒精液，剛果紅則由紅變藍，干燥后不必再用水沖洗，鏡檢。在藍色背景下見(jiàn)有透亮未染色的螺旋體。

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