7－氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA）是制備頭孢類(lèi)抗生素的重要中間體。傳統的通過(guò)青霉素化學(xué)擴環(huán)生產(chǎn)7-ADCA的方法，存在步驟復雜、環(huán)境污染等問(wèn)題。因此，建立綠色高效生產(chǎn)7-ADCA的方法是十分必要的。
中國科學(xué)院微生物研究所研究員陶勇課題組在大腸桿菌中表達青霉素擴環(huán)酶(DAOCS)，利用全細胞催化高效轉化青霉素G生成G-7-ADCA。為提高DAOCS對非天然底物青霉素G的活力，研究員楊克遷課題組通過(guò)迭代組合突變（Iterative Combinatorial Mutagenesis）獲得了酶活力較高的DAOCS-H7（Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(21):7809）。陶勇課題組通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)表達DAOCS-H7，構建轉化青霉素G生成G-7-ADCA的工程菌株。通過(guò)重構初級代謝中的三羧酸循環(huán)（TCA Cycle），將合成反應的共底物α-酮戊二酸變成反應的輔因子，通過(guò)TCA循環(huán)實(shí)現再生；通過(guò)推動(dòng)TCA循環(huán)，推動(dòng)合成反應進(jìn)行。通過(guò)減少乙酸積累、敲除宿主自身β-內酰胺酶減少底物和產(chǎn)物降解等手段進(jìn)一步提高合成反應效率。通過(guò)組合以上代謝工程手段，G-7-ADCA的產(chǎn)量從2.50 ± 0.79 mM (0.89 ± 0.28 g/L) 提高到 29.01 ± 1.27 mM (10.31 ± 0.46 g/L)，全細胞催化效率提高了11倍。
該研究工作通過(guò)對大腸桿菌初級代謝網(wǎng)絡(luò )的精巧設計，重構TCA并偶聯(lián)生物合成反應，實(shí)現高效的生物轉化。展示了通過(guò)重構的TCA循環(huán)來(lái)推動(dòng)目標酶促反應的可能性。該研究策略在α-酮戊二酸依賴(lài)型加氧酶類(lèi)以及其他與TCA循環(huán)有關(guān)聯(lián)的酶反應中具有廣泛的借鑒意義。
上述研究結果發(fā)表在PNAS上。陶勇課題組的林白雪為第一作者。陶勇和楊克遷為通訊作者。研究得到了國家自然科學(xué)基金項目和“973”項目的資助。
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