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為研究無(wú)菌檢查用隔離系統環(huán)境監測平皿微生物試驗回收率的影響因素，本文對不同來(lái)源的環(huán)境監測平皿進(jìn)行了測試。通過(guò)微生物的回收率作為評價(jià)指標，評估包裝材料、滅菌劑注入量、滅菌循環(huán)次數等因素對回收率的影響。結果表明，滅菌劑注入量、包裝材料和包裝形式對環(huán)境監測平皿上微生物回收率的影響較大：滅菌次數對回收率也有一定影響；金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌對汽化過(guò)氧化氫滅菌劑的敏感程度較高。隔離系統應用于無(wú)菌檢查時(shí)，應對培養基和樣品包裝進(jìn)行完整性驗證，排除滅菌處理可能帶來(lái)的假陰性風(fēng)險。
中國藥典2015年版(ChP 2015)首次收載了無(wú)菌檢查用隔離系統驗證指導原則，使用無(wú)菌隔離系統己成為藥品無(wú)菌檢查的趨勢。隔離系統作為傳統潔凈室的替代技術(shù)，可有效控制其內部的潔凈環(huán)境。作為一個(gè)密閉的操作系統，隔離系統通過(guò)可截留微生物的高效空氣過(guò)濾系統實(shí)現與外界的空氣交換，艙體內部采用經(jīng)驗證的方式對物品進(jìn)行表面滅菌，可用于表面滅菌的氣體有過(guò)氧化氫、二氧化氯、臭氧、過(guò)氧乙酸等，其中過(guò)氧化氫以其殺菌效果好、分解快、無(wú)殘留、對實(shí)驗用品無(wú)損害等優(yōu)點(diǎn)最為常用。
隔離系統阻隔了操作人員和艙內潔凈環(huán)境的直接接觸，結合高效的滅菌方式，極大地降低了假陽(yáng)性風(fēng)險。通常在滅菌循環(huán)過(guò)程中滅菌氣體不會(huì )穿透西林瓶、安瓿、螺旋蓋試管等密封完好的容器。然而對于某些包裝物，滅菌氣體可能會(huì )對其產(chǎn)生不利影響，造成微生物生長(cháng)的抑制，帶來(lái)假陰性風(fēng)險，這是隔離系統不同于傳統潔凈室的因素，須在驗證和應用時(shí)特別關(guān)注。所以，用戶(hù)應充分評估滅菌劑是否會(huì )因為滲透試驗耗材和待檢樣品包裝，影響低水平微生物污染的檢出。
隔離系統經(jīng)過(guò)表面滅菌，艙內可達到靜態(tài)A級潔凈度，A級環(huán)境每次開(kāi)展試驗均要監測表面微生物和沉降菌，并要定期監測浮游菌和空氣懸浮粒子。作為最常用的環(huán)境監測平皿，胰酪大豆胨瓊脂(tryptose soya agar，TSA)培養基平皿被廣泛用于環(huán)境微生物監測。用戶(hù)一般較重視TSA平皿在使用前的培養基適用性檢查，卻容易忽視其在用于隔離系統時(shí)的包裝完整性測試，確認其經(jīng)過(guò)滅菌循環(huán)后微生物的回收率是否還能達到50％～200％的要求。本研究對3種不同來(lái)源的TSA平皿進(jìn)行了測試，通過(guò)微生物試驗回收率作為評價(jià)指標，評估包裝材料、滅菌循環(huán)次數、滅菌劑注入量等因素對其微生物試驗回收率的影響。
1.儀器與材料
1.1 儀器PI一4PM型單向流無(wú)菌檢查用隔離器系統(上海東富龍愛(ài)瑞思科技有限公司)；MIR-254型微生物培養箱(日本Sanyo公司)；KS一18型生物安全柜(美國Thermo—Fisher公司)；全自動(dòng)培養基滅菌和分裝系統(瑞士Integra-Biosciences公司)。
1.2 試劑和培養基30％過(guò)氧化氫溶液(分析純，國藥集團化學(xué)試劑公司)；汽化過(guò)氧化氫滅菌化學(xué)指示劑(德國Johnson&Johnson公司)；TSA培養基(成品培養基A，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“品牌A”，某國產(chǎn)培養基品牌；成品培養基B，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“品牌B”，某進(jìn)口培養基品牌：自制培養基干粉來(lái)源為德國Merck公司)�？紤]到不同來(lái)源商品化成品TSA平皿的中和劑種類(lèi)和添加量有所差異，為排除該差異帶來(lái)的影響，從嚴設定測試條件，本研究使用的TSA平皿均未添加中和劑。
1.3 菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMC(B)10104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]和黑曲霉(Aspegillus niger)[CMCC(F)98003]，均購自中國醫學(xué)細菌保藏管理中心。
2.方法與結果
2.1 汽化過(guò)氧化氫穿透性測試將2個(gè)化學(xué)指示劑分別放入3種用于包裝TSA平皿的單層包材中并封口，采用滅菌程序B(過(guò)氧化氫注入量約為1 00 g／m3)進(jìn)行一次滅菌循環(huán)，滅菌結束后觀(guān)察化學(xué)指示劑的變色情況，共進(jìn)行3次測試，以研究汽化過(guò)氧化氫穿透包材的能力。
結果如表1所示，汽化過(guò)氧化氫能夠穿透紙塑包裝，60 g／m3醫用透析紙相對于70 g／m3醫用透析紙包裝更易被穿透，而汽化過(guò)氧化氫不能穿透聚酰胺／聚乙烯(PA／PE)復合膜和聚丙烯+聚乙烯．乙烯／乙烯醇共聚物一聚乙烯(PP一(PE．EVOH—PE))共擠膜包裝。
2.2 單層包裝各試驗菌的回收率
將2種商品化成品TSA平皿拆掉外部?jì)蓪影b，保留單層包裝，自制平皿僅作單層包裝，試驗組放入隔離器系統操作艙內，分別用4種不同的模式進(jìn)行表面滅菌處理：
(1)滅菌程序A(過(guò)氧化氫注入量約為50 g／m3)進(jìn)行一次滅菌循環(huán)；
(2)滅菌程序A進(jìn)行連續兩次滅菌循環(huán)；
(3)滅菌程序B(過(guò)氧化氫注入量約為100 g／m3)進(jìn)行一次滅菌循環(huán)；
(4)滅菌程序B進(jìn)行連續兩次滅菌循環(huán)。每種模式分別進(jìn)行3次測試。
滅菌程序A和B均經(jīng)過(guò)滅菌驗證，均能使生物指示劑下降超過(guò)6個(gè)對數值，可用于日常無(wú)菌檢查。同步設置陽(yáng)性對照組，不進(jìn)行表面滅菌處理。
表面滅菌結束后，將試驗組TSA平皿轉移至生物安全柜內，和陽(yáng)性對照組TSA平皿同步進(jìn)行涂布試驗，涂布用的5種試驗菌按照ChP 2015四部通則1105的規定，制成含菌量不超過(guò)100 CFu的菌懸液，每種試驗菌平行涂布2塊平皿，涂布完成后置規定條件培養。
如表2所示，在單層包裝試驗條件下，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌對汽化過(guò)氧化氫滅菌的敏感程度較高，品牌A在滅菌劑注入量達到100 g／m3時(shí)，金黃色葡萄球菌的平均回收率小于50％，在滅菌劑注入量達到200 g／m3時(shí)，銅綠假單胞菌的平均回收率為44．6％，金黃色葡萄球菌的回收率低至18．6％�？莶菅挎邨U菌、白色念珠菌、黑曲霉則對過(guò)氧化氫滅菌氣體的敏感程度較低，3種TSA平皿在4種滅菌模式下的平均回收率均達到了90％以上。
2.3雙層包裝各試驗菌的回收率
根據單層包裝試驗結果，補充了以下試驗：將2種商品化成品TSA平皿保留兩層包裝，自制平皿作兩層包裝，試驗組放入隔離器系統操作艙內，分別按“2．2”項下的四種模式進(jìn)行表面滅菌處理，陽(yáng)性對照組不進(jìn)行表面滅菌處理。表面滅菌結束后，按“2．2”項下方法進(jìn)行涂布試驗，試驗菌為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。
結果如表3所示，品牌A在保留雙層包裝后，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在4種滅菌模式下的微生物試驗回收率均達到了80％以上，品牌B和自制平皿的微生物試驗回收率仍保持在80％以上。
商品化的環(huán)境采樣平皿包裝常含有透氣組件，在隔離系統的表面滅菌處理過(guò)程中，滅菌劑可能存在穿透作用。此次研究通過(guò)化學(xué)指示劑試驗發(fā)現在隔離系統常用的汽化過(guò)氧化氫滅菌方式處理下，PA／PE復合膜和PP一(PE—EVOH—PE)共擠膜包裝不易被穿透，而紙塑包裝形式可能被汽化過(guò)氧化氫穿透，穿透滲入的過(guò)氧化氫可能會(huì )對采樣平皿造成不利影響，而通過(guò)微生物回收率試驗可以直觀(guān)地驗證其效果。本次研究發(fā)現確實(shí)存在汽化過(guò)氧化氫穿透紙塑包裝從而影響培養基性能的情況，而較薄規格的紙塑包裝相對于較厚規格的包裝受影響更為明顯。
3.討論
目前市面上的商品化環(huán)境監測培養基多為三層無(wú)菌包裝，該設計主要針對潔凈室不同潔凈級別間的傳遞需要，而隔離系統采用高效的表面滅菌，包裝材料對汽化過(guò)氧化氫的滲透和吸附作用會(huì )影響包裝內環(huán)境監測平皿的微生物試驗回收率。建議用戶(hù)不必拘泥于是否一定拆至單層包裝，而是要考慮包裝材質(zhì)和滅菌過(guò)程的適應性。滅菌次數對紙塑包裝平皿的微生物試驗回收率有一定程度的影響，用戶(hù)可根據隔離系統所使用的滅菌劑特點(diǎn)，選擇添加中和劑的環(huán)境菌測試平皿，一定程度上可以消除滅菌氣體的抑菌作用。
汽化過(guò)氧化氫作為一種典型的低溫蒸汽滅菌方式，其滅菌過(guò)程中的影響因素較為復雜，而滅菌劑的注入量是影響過(guò)氧化氫滅菌效果的關(guān)鍵因素。本次研究也發(fā)現滅菌劑注入量明顯影響了敏感菌株的回收率，甚至可能達不到藥典規定的回收率要求，用戶(hù)應根據生產(chǎn)廠(chǎng)商的使用要求、自身工作需要等綜合測試評估，開(kāi)發(fā)出合理的滅菌程序，避免因盲目追求過(guò)量殺滅造成滅菌劑殘留和假陰性風(fēng)險增加等問(wèn)題。滅菌循環(huán)次數、滅菌劑注入量作為隔離系統滅菌程序的一部分，是經(jīng)開(kāi)發(fā)驗證固定下來(lái)的，在此基礎上用戶(hù)可對TSA平皿的包裝材料與滅菌程序的兼容性進(jìn)行驗證，若通過(guò)可不必重復驗證。滅菌程序或包裝材料任意一方更改時(shí)，應重新驗證。建議使用經(jīng)驗證的滅菌程序進(jìn)行不少于兩次連續滅菌，以此嚴苛條件對包裝材料的包裝完整性進(jìn)行測試。本次研究也發(fā)現，有些試驗菌對過(guò)氧化氫表面滅菌表現出較強的耐受能力，而有些試驗菌則較為敏感，建議用戶(hù)在進(jìn)行環(huán)境監測平皿的包裝完整性研究時(shí)重點(diǎn)關(guān)注，另外可以增加歷史環(huán)境菌作為測試菌株。
需要說(shuō)明的是，本文提供的環(huán)境監測平皿包裝完整性測試思路可供其他案例參考，但本文中所測試的微生物回收率結果不能直接使用，因為不同案例隔離系統滅菌程序的差異，所測試的環(huán)境菌平皿培養基來(lái)源的差異、包裝材料的差異都會(huì )影響最終結果，應以各案例實(shí)際測試結果為準。
