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2月6日，國家衛生健康委發(fā)布了新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案（第四版），同時(shí)作為附件發(fā)布了新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗室檢測技術(shù)指南（第四版）。
為指導各級疾控部門(mén)和其他相關(guān)機構開(kāi)展新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗室檢測工作，特制定本技術(shù)指南。本指南主要介紹目前已經(jīng)比較成熟、易于實(shí)施的核酸檢測方法。
一、標本采集
（一）采集對象。
新型冠狀病毒肺炎疑似病例、臨床診斷病例（僅限湖北�。┖途奂圆±�，其他需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進(jìn)一步篩查檢測的環(huán)境或生物材料（如溯源分析）。
（二）標本采集要求。
1.從事新型冠狀病毒檢測標本采集的技術(shù)人員應經(jīng)過(guò)生物安全培訓（培訓合格）和具備相應的實(shí)驗技能。采樣人員個(gè)人防護裝備（personal protective equipment，PPE）要求：N95 及以上防護口罩、護目鏡、連體防護服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應及時(shí) 更換外層乳膠手套。
2.住院病例的標本由所在醫院的醫護人員采集。
3.密切接觸者標本由當地指定的疾控機構、醫療機構負責 采集。
4．根據實(shí)驗室檢測工作的需要，可結合病程多次采樣。
（三）標本采集種類(lèi)。
每個(gè)病例必須采集急性期呼吸道標本（包括上呼吸道標本 和下呼吸道標本）；重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標本（如支氣管 或肺泡灌洗液等）；出現眼部感染癥狀的病例，需采集眼結膜拭子標本；出現腹瀉癥狀的病例，需留取便標本�？筛鶕R床表 現與采樣時(shí)間間隔進(jìn)行采集。
其他研究材料依據設計需求采集。
標本種類(lèi)：
1.上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物等。
2.下呼吸道標本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管 灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本。
3.血液標本：盡量釆集發(fā)病后7天內的急性期抗凝血。采集量5ml,以空腹血為佳，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。
4.血清標本：盡量釆集急性期、恢復期雙份血清。第一份 血清應盡早（最好在發(fā)病后7天內）釆集，第二份血清應在發(fā)病 后第3～4周釆集。采集量5ml,建議使用無(wú)抗凝劑的真空釆血管。 血清標本主要用于抗體的測定，從血清抗體水平對病例的感染狀況進(jìn)行確認。血清標本不進(jìn)行核酸檢測。
5.眼結膜標本：出現眼部感染癥狀的病例需采集眼結膜拭子標本。
6.便標本：出現腹瀉癥狀的患者需采集便標本。
（四）標本采集方法。
1.咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄 去，旋緊管蓋。
2.鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻 道內鼻腭處，停留片刻后緩慢轉動(dòng)退出。取另一根聚丙烯纖維 頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側鼻孔。上述兩根拭子 浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。
3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器 從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部 插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導 尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集器）。
4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml 采樣液的50ml螺口塑料管中。
5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1 次（亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集）。
6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過(guò)口或鼻經(jīng) 過(guò)咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管 分支開(kāi)口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50 ml，總量100～250ml，不應超過(guò)300ml。
7.血液標本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集 血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘， 分別收集血漿和血液中細胞于無(wú)菌螺口塑料管中。
8.血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜 置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無(wú)菌螺口塑 料管中。
9.糞便標本：如患者發(fā)病早期出現腹瀉癥狀，則留取糞便 標本3-5ml；
10.眼結膜拭子標本：眼結膜表面用拭子輕輕擦拭后，將 拭子頭進(jìn)入采樣管中，尾部棄去，懸緊管蓋。
其他材料：依據設計需求規范采集。
（五）標本包裝。
標本采集后在生物安全二級實(shí)驗室生物安全柜內分裝。
1.所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍
的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類(lèi)、姓名及 采樣日期。
2.將密閉后的標本放入大小合適的塑料袋內密封，每袋裝 一份標本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術(shù)細 則》相應的標準。
3. 涉及外部標本運輸的，應根據標本類(lèi)型，按照A類(lèi)或B類(lèi) 感染性物質(zhì)進(jìn)行三層包裝。
（六）標本保存。
用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進(jìn)行檢測，能在24 小時(shí)內檢測的標本可置于4℃保存；24小時(shí)內無(wú)法檢測的標本則 應置于-70℃或以下保存（如無(wú)-70℃保存條件，則于-20℃冰箱 暫存）。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可長(cháng)期保存。應設立 專(zhuān)庫或專(zhuān)柜單獨保存標本。標本運送期間應避免反復凍融。
（七）標本送檢。
標本采集后應盡快送往實(shí)驗室，如果需要長(cháng)途運輸標本，建議采用干冰等制冷方式進(jìn)行保藏。
1.上送標本。
各�。ㄗ灾螀^、直轄市）聚集性病例的標本，上送中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所進(jìn)行檢測復核，并附樣本送 檢單（見(jiàn)附件）。
2.病原體及標本運輸。
2.1 國內運輸。
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類(lèi)屬于A(yíng)類(lèi)，對應的聯(lián)合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細則》的PI602分類(lèi)包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類(lèi)，對應的聯(lián)合國編號為UN3373， 包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術(shù)細則》的PI650分類(lèi)包裝要求；通過(guò)其他交通工具運輸的可參照 以上標準包裝。
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類(lèi)的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規 定》（原衛生部令第45號）辦理《準運證書(shū)》。
2.2 國際運輸。
新型冠狀病毒毒株或樣本在國際間運輸的，應規范包裝，按照《出入境特殊物品衛生檢疫管理規定》辦理相關(guān)手續，并滿(mǎn)足相關(guān)國家和國際相關(guān)要求。
2.3 毒株和樣本管理。
新型冠狀病毒毒株及其樣本應由專(zhuān)人管理，準確記錄毒株和樣本的來(lái)源、種類(lèi)、數量，編號登記，采取有效措施確保毒 株和樣本的安全，嚴防發(fā)生無(wú)用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。
二、新型冠狀病毒的實(shí)驗室檢測
新型冠狀病毒感染的常規檢測方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 鑒定。任何新型冠狀病毒的檢測都必須在具備適當條件的實(shí)驗 室由經(jīng)過(guò)相關(guān)技術(shù)安全培訓的人員進(jìn)行操作。本指南中的核酸 檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開(kāi)放讀碼框1ab（open reading frame 1ab ， ORF1ab ） 和 核 殼 蛋 白 （ nucleocapsid protein，N）。
在實(shí)驗室要確認一個(gè)病例為陽(yáng)性，滿(mǎn)足以下條件： 同一份標本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標（ORF1ab、N）特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結果均為陽(yáng)性。如果出現單個(gè)靶標陽(yáng)性的 檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。
陰性結果也不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過(guò)早或過(guò)晚；沒(méi)有正確的保存、運輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。
三、實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸
（一）目的。
規范實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的工作程序，保證實(shí)驗結果的正確可靠。
（二）范圍。
適用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸。
（三）職責。
檢測人員：負責按照本檢測細則對被檢樣本進(jìn)行檢測。
復核人員：負責對檢測操作是否規范以及檢測結果是否準確進(jìn)行復核。
部門(mén)負責人：負責對科室綜合管理和檢測報告的審核。
（四）樣本接收和準備。
核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等；待檢樣本的狀態(tài)如有異常，需注明；待檢樣本應存放于-70℃冰箱保存。
（五）檢測項目。
1.新型冠狀病毒核酸測定（實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法） 推薦選用針對新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區域的引物和探針。
靶標一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應體系及反應條件參考相關(guān)廠(chǎng)家試劑盒說(shuō)明。
2.結果判斷 陰性:無(wú)Ct值或Ct≥40。 陽(yáng)性：Ct值<37，可報告為陽(yáng)性。
灰度區：Ct值在37-40之間，建議重復實(shí)驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線(xiàn)有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性,否則為陰性。 注：如果用的是商品化試劑盒，則以廠(chǎng)家提供的說(shuō)明書(shū)為準。
四、病原生物安全實(shí)驗活動(dòng)要求
根據目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)特點(diǎn)、流行病學(xué)特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分 類(lèi)中第二類(lèi)病原微生物進(jìn)行管理，具體要求如下：
（一）病毒培養。
病毒培養是指病毒的分離、培養、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實(shí)驗等操作。 上述操作應當在生物安全三級實(shí)驗室的生物安全柜內進(jìn)行。使用病毒培養物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒 培養等同級別的實(shí)驗室和防護條件下進(jìn)行，裂解劑或滅活劑加 入后可比照未經(jīng)培養的感染性材料的防護等級進(jìn)行操作。實(shí)驗室開(kāi)展相關(guān)活動(dòng)前，應當報經(jīng)國家衛生健康委批準，取得開(kāi)展 相應活動(dòng)的資質(zhì)。
（二）動(dòng)物感染實(shí)驗。
動(dòng)物感染實(shí)驗是指以活病毒感染動(dòng)物、感染動(dòng)物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動(dòng)物特殊檢查、感染動(dòng)物排泄物處 理等實(shí)驗操作，應當在生物安全三級實(shí)驗室的生物安全柜內操作。實(shí)驗室開(kāi)展相關(guān)活動(dòng)前，應當報經(jīng)國家衛生健康委批準， 取得開(kāi)展相應活動(dòng)的資質(zhì)。
（三）未經(jīng)培養的感染性材料的操作。
未經(jīng)培養的感染性材料的操作是指未經(jīng)培養的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進(jìn)行的病毒抗原檢測、血清學(xué)檢測、 核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應當在生物安全二級實(shí)驗室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級實(shí)驗室的個(gè)人 防護。
（四）滅活材料的操作。
感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測、抗原檢測、血清學(xué)檢測、生化分析等操作應當在生物安全二級實(shí)驗室進(jìn)行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作， 可以在生物安全一級實(shí)驗室進(jìn)行。
來(lái)源：國家衛健委
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