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一次關(guān)于利用產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行2個(gè)國標檢測的方法證實(shí)過(guò)程及其收獲
作者：菩提
編輯：兔兔子
來(lái)源：實(shí)驗助手app
特別鳴謝：青島海博生物
1.前言
（一）為什么要檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌？
因為這個(gè)菌是條件致病菌，時(shí)不時(shí)跳出來(lái)害人。產(chǎn)氣莢膜梭菌是條件致病菌，最大的特點(diǎn)是快速分解肌肉和結締組織里的糖，產(chǎn)生大量氣體（暴烈發(fā)酵實(shí)驗可證明），造成腫脹和致�。ㄖ饕袎木也。�。條件致病菌是個(gè)啥東西？就是能讓你得病，但有條件：條件1：免疫缺陷或免疫力低下的人容易感染。有免疫力的人可以帶著(zhù)這個(gè)菌到處亂跑，沒(méi)事。跑著(zhù)跑著(zhù)遇到一個(gè)免疫力缺陷或免疫力低（老、弱、�。┑娜�，把菌給了對方，那被接觸的朋友就比較慘。
條件2：菌去了不該去的地方。比如產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道里過(guò)的好好地，結果去了受傷的肌肉或結締組織，那么菌就要吃肉，人就要生病了。
條件3：滿(mǎn)足任意條件1或條件2都可能致病。
（二）產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法建立意義
除了是條件致病菌外，產(chǎn)氣莢膜梭菌種下不同菌株產(chǎn)毒能力也各不相同，加起來(lái)能生產(chǎn)15種以上毒素，其中以ABCDE五種毒素最為典型。產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法建立的意義還在于產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在在自然界中，范圍廣兄弟多，所以容易被它污染；產(chǎn)氣莢膜梭菌感染人的方式主要是菌從口入，病從口入，所以產(chǎn)氣莢膜梭菌是食源性的條件致病菌。
當然這是國家制定標準要考慮的事情，我們知道檢測方法建立很有意義就好了。作為檢測人員，我們更重要的關(guān)心是怎么做好實(shí)驗，讓實(shí)驗方法運用的更為流暢，有時(shí)候有一定微生物學(xué)基礎的可能會(huì )好些，但就目前國情，從事微生物檢測的還有許多正在努力學(xué)習提高的非微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，所以我們檢測人員更重要的是要知道每一步檢測的目的以及為什么這么做，當檢測出現疑惑或和檢測標準出現不符時(shí)候該怎么解決更有意義。
（三）產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法比較
鴻蒙初開(kāi)，這世上本無(wú)對錯，自從有了標準和比較就有了優(yōu)劣的分別。
挑選的2個(gè)現行有效國標，其一為：GB 4789.13-2012《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗》。（以下簡(jiǎn)寫(xiě)，用標準號“GB 4789.13-2012”代替標準全名）；其二為：GB 8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》58產(chǎn)氣莢膜梭菌。（以下簡(jiǎn)寫(xiě)，用“GB 8538-2016.58”代替標準對應產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測項目）。
產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法有許多，挑選這2個(gè)標準進(jìn)行方法學(xué)比較。是因為這2個(gè)標準使用的比較多，也是我最近擴項用到的，所以更熟悉一些。二個(gè)標準適用范圍有所不同，GB 4789.13-2012適用于食品，GB 8538-2016適用于飲用天然礦泉水，除卻GB 4789.13-201傾注平板方法和GB 8538-2016過(guò)濾水樣外，其他檢測部分其實(shí)是相似和可以相互參考和比較優(yōu)劣長(cháng)短之分的。不影響方法的比較和探索。
2.產(chǎn)氣莢膜梭菌的分類(lèi)學(xué)地位
產(chǎn)氣莢膜梭菌顧名思義能產(chǎn)氣，有莢膜，是梭菌。這也是最初科學(xué)家定名時(shí)候的特點(diǎn)，這樣的好處在于名字就帶了菌的特色，特點(diǎn)鮮明（當然只是中文名有這個(gè)特點(diǎn)）。產(chǎn)氣莢膜梭菌拉丁學(xué)名叫Clostridium perfringens，目前所有的細菌拉丁文學(xué)名均被微生物權威分類(lèi)學(xué)手冊“伯杰氏手冊”（伯杰氏系統細菌學(xué)手冊，Berger’s Manual of Systermatic Bacteriology）收錄。
簡(jiǎn)單介紹一下伯杰氏手冊。伯杰氏手冊已經(jīng)發(fā)展到第9版了，前8版國內基本都有中文版。第9版國內較少，這不利于微生物學(xué)發(fā)展，特意放出伯杰氏手冊英文版封面（下圖）供大家參考。伯杰手冊第9版共5卷7冊（紙質(zhì)版加起來(lái)重達15公斤）：
卷1：古細菌和深分支菌及光合細菌，
卷2：變形桿菌（三冊）A冊導論，B冊γ（讀音gamma）-變形桿菌，C冊（α-，β-，δ-，ε-變形桿菌），
卷3：卷3厚壁菌門(mén)，
卷4：（擬桿菌, Spirochaetes螺旋體門(mén), Tenericutes (Mollicutes)無(wú)壁菌門(mén)（柔壁菌門(mén)）,Acidobacteria酸桿菌門(mén), Fibrobacteres纖維桿菌門(mén), Fusobacteria梭菌屬, Dictyoglomi網(wǎng)團菌門(mén), Gemmatimonadetes芽單孢菌門(mén), Lentisphaerae黏膠球形菌門(mén)），
卷5（到目前為止總共才出到5卷A冊）：A冊放線(xiàn)菌門(mén)。
產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)現比伯杰氏手冊的創(chuàng )立早，所以當時(shí)世界各國發(fā)現這個(gè)菌的科學(xué)家命名時(shí)就根據自己的意愿起名字（未約定俗成，也無(wú)什么特定規則），1898年Veillon和Zuber發(fā)現時(shí)叫做“產(chǎn)氣莢膜桿菌（Bacillus perfringens）”，在另外一個(gè)地方，1900年Migula發(fā)現并把它叫做“魏氏細菌（Bacterium welchii）”。在1980年世界上又召開(kāi)了一次細菌學(xué)大會(huì )，對菌種命名進(jìn)行了統一，對于以前的各種菌歸到一個(gè)清單里（Lists 1980），產(chǎn)氣莢膜梭菌也在其中。定名為:產(chǎn)氣莢膜梭菌,全名叫：“Clostridium perfringens (Veillon and Zuber 1898) Hauduroy et al.1937,species.”，這一套規則是為了保證其唯一性也為了紀念發(fā)現的科學(xué)家，規則不難看出就是：拉丁文屬名（斜體字）_拉丁文種名（斜體字）_發(fā)現人名_發(fā)現年_分類(lèi)學(xué)位置（比如種），“_”表示用空格隔開(kāi)，此后再有誰(shuí)發(fā)現了新種以及隨著(zhù)時(shí)間和認識的變化要進(jìn)行合并更改都需要依照一套嚴格的規則進(jìn)行。
所以產(chǎn)氣莢膜梭菌在分類(lèi)學(xué)地位上面是“種”（species），隸屬于厚壁菌門(mén)梭狀芽孢桿菌屬。菌體特點(diǎn)是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，菌體粗大，二端鈍圓，體內可形成芽孢。有莢膜，無(wú)鞭毛，厭氧生長(cháng)。
圖2：產(chǎn)氣夾膜梭菌革蘭氏染色鏡檢觀(guān)察
芽孢是抗逆環(huán)境的產(chǎn)物，生存環(huán)境變惡劣時(shí)芽孢菌才會(huì )產(chǎn)生芽孢。2個(gè)國標方法中不易看到芽孢，主要是因為：
（1）標準提供的TSC和SPS培養基營(yíng)養較好，
（2）20-24h就觀(guān)察結果，時(shí)間較短，還未形成。
產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生芽孢的特點(diǎn)是產(chǎn)生芽孢時(shí)菌體不會(huì )膨大，芽孢形成在菌體中部。
3.實(shí)驗材料準備
（一）設備及材料準備
1.配培養基所用設備：
（1）天平（百分之一以上天平，），
（2）純水機（制備培養基配制用水，或用蒸餾水機制備蒸餾水），
（3）高壓蒸汽滅菌器，
2.前處理設備：
（1）天平（百分之一以上天平，稱(chēng)取食品樣品用，略），
（2）均質(zhì)器（拍打式均質(zhì)器），
（3）旋渦混勻儀（遇到不少人不配備混勻儀，習慣用手振搖。建議使用混勻儀，定量實(shí)驗，以免手振搖不均勻帶來(lái)風(fēng)險。）
3.操作設備：
（1）超凈臺(略)，
（2）2級生物安全柜，
（3）三聯(lián)過(guò)濾器（過(guò)濾水樣），
4.培養材料及設備：
產(chǎn)氣莢膜梭菌是厭氧菌，在厭氧環(huán)境種生長(cháng)良好。常用的培養方法有：厭氧產(chǎn)氣袋法、厭氧罐法、厭氧盒、厭氧手套箱等。
為了比較實(shí)驗，我做實(shí)驗時(shí)準備了以下設備。
（1）厭氧袋（配套氧氣指示劑、厭氧產(chǎn)氣袋。厭氧產(chǎn)氣袋有時(shí)也叫厭氧包或培養袋），
（2）厭氧培養盒（配套氧氣指示劑、厭氧產(chǎn)氣袋），
（3）厭氧操作箱（也叫手套箱，配氣制造厭氧環(huán)境），
（4）三氣培養箱（CO2，N2，O2），
（5）普通培養箱（用于厭氧產(chǎn)氣袋和厭氧盒的存放培養裝置）。
（二）培養基和試劑：
1. 0.1%蛋白胨水，
2.胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂（TSC），（添加劑D-環(huán)絲氨酸）；
3.亞硫酸鈉鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂基礎（SPS添加劑）
4.液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG)，
5.含鐵牛奶培養基，
6.緩沖-動(dòng)力硝酸鹽（硝酸鹽還原試劑，鋅粉），買(mǎi)成品試劑盒驗收后使用，方便。
7.乳糖-明膠培養基，
8.卵黃瓊脂培養基。
4.標準菌株準備
（警告：從標準菌株開(kāi)始都需要在生物安全柜里正確操作，并注意個(gè)人防護）
（一）本單位使用的陽(yáng)性對照菌株：產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949。
本單位使用的陰性對照菌株：艱難梭菌CICC22951。
（二）標準菌株的選擇。
標準菌株的選擇以美國機構ATCC最為出名，但也不是他一家獨大，因為伯杰手冊明確規定了，只有一家存有的標準菌株不被承認，也就是說(shuō)國際上當某一個(gè)人或機構發(fā)現了一個(gè)新種時(shí)，必須同時(shí)送往2家被認可的機構保藏，這個(gè)新種才會(huì )被國際社會(huì )承認。這也是為了反壟斷，有時(shí)候一株菌擁有巨大的商業(yè)利益，一家私藏，不利于微生物學(xué)科的發(fā)展。
所以作為我們，可能知道的最出名的就是菌種保藏中心也就是美國的ATCC機構了，但是，不是美國ATCC一家獨大�！安苁鲜謨浴绷信e了被承認的機構的標準菌株信息,只要紙質(zhì)材料能溯源到這幾家單位其中之一即可。
（三）伯杰手冊推薦的關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌標準標準菌株信息。
我把手冊中關(guān)于我們這次產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗實(shí)驗用得到的陽(yáng)性對照菌和陰性對照菌信息摘錄如下：
1.陽(yáng)性對照菌株：
（1）產(chǎn)氣莢膜梭菌，Clostridium perfringens，“Type strain: ATCC 13124= BCRC (formerly CCRC) 10913 = CCUG 1795 = CIP 103409 = DSM 756 = JCM 1290 = LMG 11264 = NCAIM B.01417 = NCCB 89165 = NCIMB 6125 = NCTC 8237”。（參考：我單位所選產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949，可溯源到ATCC13124）。
2.陰性對照菌株：嚴格厭氧菌（任選其一即可）。
（2）艱難梭菌Clostridioides difficile，Type strain: AS 1.2184 = ATCC 9689= BCRC (formerly CCRC) 10642 = CCUG 4938 = CIP 104282 = DSM 1296 = JCM 1296 = LMG 15861 = NCIMB 10666 = NCTC 11209。（我單位所選艱難梭菌CICC22951，可溯源到ATCC43593）。
（3）生孢梭菌Clostridium sporogenes，Type strain: ATCC 3584= BCRC (formerly CCRC) 11259 = CCUG 15941 = CIP 106155 = DSM 795 = JCM 1416 = LMG 8421 = NCIMB 10696 = NCTC 13020.
其中國家食品藥品監督管理總局科技和標準司編著(zhù)的《微生物檢驗方法 食品安全國家標準 實(shí)操指南》（中國醫藥科技出版社2017.10）版本第143頁(yè)圖13.6乳糖-明膠液化實(shí)驗中生孢梭菌的編號有誤，ATCC64941應改成CMCC64941，大家注意一下。別真買(mǎi)成了ATCC64941，那是Cryptococcus neoformans菌。
（4）索氏梭菌Clostridium sordellii，Type strain: ATCC 9714= BCRC (formerly CCRC) 10649 = CCUG 9284 = CIP 103658 = DSM 2141 = JCM 3814 = LMG 15708 = NCIMB 10717。
（參考：我單位所用的標準菌株均有標準菌株證書(shū)，可溯源到上述國際單位，購買(mǎi)回來(lái)后均進(jìn)行了技術(shù)驗收，合格后投入使用；使用前登記造冊，編制菌株的唯一性順序號。每次使用周期性（一月一次）驗收，并繼續完善記錄并都詳細記錄在冊。保證菌株從買(mǎi)到手，技術(shù)驗收，傳代，使用直至銷(xiāo)毀均可溯源，同時(shí)保證菌株性能在使用期限內是有效的。
如果其他單位要購買(mǎi)（或已經(jīng)購買(mǎi)了）標準菌株，需核查菌株信息，要有材料能證明其可溯源到以上我列舉的國際單位，同時(shí)也要做好菌株管理工作。）
5.實(shí)驗操作
在看我寫(xiě)這部分之前，建議大家把GB4789.13-2012和GB 8538-2016.58都分別讀一下，不然有可能有地方看不明白。
圖：幾種產(chǎn)氣莢膜梭菌培養基@青島海博
（一）培養基制備
1. 0.1%蛋白胨水、TSC，SPS配制。
在配制培養基過(guò)程中，TSC和SPS做真實(shí)樣品時(shí)添加添加劑以抑制雜菌，模擬實(shí)驗沒(méi)有添加（添加劑價(jià)格不菲）。
TSC和SPS培養基脫水合成培養基基礎的模樣（添加劑另配）
2. FTG培養基配制。
FTG需增加少量瓊脂。加瓊脂主要是怕液體流動(dòng)回流，厭氧環(huán)境被破壞。不同意見(jiàn)：實(shí)際過(guò)程中我加和不加都做過(guò)，最初不加是因為忘記了：（。如果動(dòng)作輕緩，管內FTG較長(cháng)，不加瓊脂也不影響菌的繁殖生長(cháng)，注意觀(guān)察會(huì )發(fā)現，不加瓊脂時(shí)，管子放到厭氧盒內很快就能變黃（厭氧狀態(tài)）。
FTG滅菌完成后注意放在厭氧條件下（比如厭氧盒或厭氧操作箱），這樣可以使氧化層下行較慢。如果沒(méi)有條件就臨時(shí)煮沸趕氣。等再變成淺黃色包裹緊管口，阻止氧氣進(jìn)入。經(jīng)過(guò)反復幾次實(shí)驗，18*180管中配制15mL以上為宜（我一般配20mL）。
FTG剛配出來(lái)時(shí)樣子和滅菌后樣子（有1管塞子崩了，量變少了）
FTG滅菌后↑
FTG滅菌前↑
3.含鐵牛奶培養基的配制。
這個(gè)培養基建議不要用脫水合成成品培養基。而購買(mǎi)全脂鮮牛奶加硫酸亞鐵。滅菌溫度最好選用115℃，5min，試管放在滅菌鍋里的位置遠離加熱管及內壁，以免瞬間過(guò)熱變性絮凝。滅完菌及早取出，急速冷水速冷卻。
配制含鐵牛奶培養基折騰我不少時(shí)間，首先就是商品化脫水培養基并不好使，所以我特意去買(mǎi)新鮮未脫脂的牛奶，然后添加完硫酸亞鐵，混勻后滅菌。第一次115℃，10min，失敗。蛋白質(zhì)絮凝變性了。設定這個(gè)溫度時(shí)長(cháng)是根據GB 8538-2016來(lái)的，同時(shí)加上我們滅菌鍋校準溫度點(diǎn)有115℃。痛定思痛，分析問(wèn)題，找失敗原因。分析出3個(gè)可能原因：
（1）和牛奶有關(guān)。
（2）和滅菌鍋內放置位置有關(guān)。
（3）滅菌時(shí)長(cháng)有關(guān)。
找出原因捋起袖子加油干，去市場(chǎng)買(mǎi)了好幾種全脂牛奶，然后配成培養基，量不變。
在滅菌鍋內不同位置（三層，每次2個(gè)，框中心1個(gè)，邊上1個(gè)）放置培養基，115℃10min滅菌；另一批次115℃，5min滅菌。滅菌完馬上取出自來(lái)水急速冷卻。實(shí)驗后現象是：115℃，5min的均正常，沒(méi)絮凝。115℃，10min的時(shí)有絮凝。同時(shí)發(fā)現較貴的牛奶絮凝的少或沒(méi)有絮凝。培養一周，無(wú)菌生長(cháng)，證明了115℃，5min可滅菌，滿(mǎn)足實(shí)驗要求。
4.緩沖-動(dòng)力硝酸鹽培養基，乳糖-明膠培養基，買(mǎi)的成品試劑盒，卵黃瓊脂培養基按要求配置沒(méi)有問(wèn)題。
（二）樣品處理
1.固體樣品處理。冷藏冷凍樣品提前拿出來(lái)按要求化凍。
固體樣品稱(chēng)取25g±0.1g樣品，放入均質(zhì)袋，加入225mL預先滅菌好的稀釋液，均質(zhì)1min或2mins（我們內部規定2mins），然后進(jìn)行10倍稀釋梯度稀釋。
2.液體食品樣品處理。
液體樣品GB4789.13-2012上沒(méi)提，根據GB 4789系列其他標準稀釋就好了，比如25mL加入225mL預先加了一些玻璃珠的滅好的稀釋液，混勻打散，然后進(jìn)行10倍稀釋梯度稀釋。也可以用均質(zhì)袋均質(zhì)（均質(zhì)就不要加玻璃珠了）。
3.天然飲用礦泉水樣品處理。
過(guò)濾法，混勻水樣。配備0.1%蛋白胨水，用于過(guò)濾后沖洗過(guò)濾設備。
4.關(guān)于食品樣品用的稀釋液選擇問(wèn)題。
我們做檢測時(shí)候一般用的稀釋液主要有四種：純水，0.85%生理鹽水，磷酸鹽緩沖溶液，蛋白胨水。有時(shí)候有人問(wèn)稀釋液怎么選擇，個(gè)人理解是這樣的：只要能有利于樣品中的菌活下來(lái)就是好的稀釋液。所以如果知道產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程，知道菌都經(jīng)歷了什么，就可以更好的選擇合適的稀釋液，如果不知道過(guò)程，那我們就要知道四種稀釋液的各有什么優(yōu)點(diǎn)，方便自己選擇。
（1）純水沒(méi)有緩沖能力，受傷的菌可能會(huì )活不過(guò)來(lái)。
（2）0.85%生理鹽水，一般菌都適宜，氯化鈉是細胞膜鈉-鉀泵的鈉主要的提供者，同時(shí)0.85%這個(gè)濃度能平衡胞內胞外滲透壓，所以對菌是有利的。
（3）磷酸鹽緩沖溶液、優(yōu)點(diǎn)就是包容性好，緩沖能力強，能讓菌在酸堿中起到一個(gè)保護作用，而不會(huì )因酸堿引起的波動(dòng)造成菌二次傷害或死亡，當然這也是相對的，樣品過(guò)酸過(guò)堿需要調節pH至中性左右為宜。
（4）蛋白胨水，又比以上稀釋液要好，因為里面提供了一定的蛋白胨營(yíng)養物質(zhì)，有利于瀕死細菌的緩活過(guò)來(lái)。
當然了，緩沖溶液絕不止這4種，如果想要更好的又有營(yíng)養又有緩沖能力，也是可以復配出更好的稀釋液的。凡事都要講究性?xún)r(jià)比，這個(gè)方法里面選擇0.1%蛋白胨水已能滿(mǎn)足要求。
（三）稀釋
全程用標準菌株代替樣品，所以稀釋的就是標準菌株的稀釋?zhuān)瑥念A先長(cháng)好的菌苔，取1接種環(huán)培養好的菌株，加入9mL蛋白胨水里打散，混勻，比對0.5麥氏比濁管，差不多就可以認為此為10的8次方菌液（概數，因為后續會(huì )有好幾個(gè)稀釋度保證有符合要求的菌落數可以計數，所以不必擔心濃度偏差了）。此設為菌液原液，然后按照10倍梯度稀釋制成10-1~10-6系列稀釋液。
二個(gè)方法的稀釋液均用此系列稀釋液稀釋液進(jìn)行實(shí)驗。
（四）倒皿
1. GB4789.13-2012采用傾倒法，取1mL菌液，加入無(wú)菌皿中，傾注TSC瓊脂培養基，混勻，冷卻，每稀釋度2皿，10-1~10-6共計14皿（帶2個(gè)空白，稀釋液用1mL0.1蛋白胨水）。同時(shí)用SPS傾注一份，作為對比使用，冷卻后覆蓋同樣的培養基5-10mL。
2. GB 8538-2016采用傾注法和過(guò)濾法同時(shí)進(jìn)行。傾注法同GB4789.13-2012，只是傾注培養基用的是SPS。過(guò)濾法，取1mL水樣加入50mL預先滅好的0.1mL蛋白胨水中，混勻后過(guò)濾，做2份，濾膜貼TSC和SPS培養基上培養。
（五）培養
將以上平板放到厭氧產(chǎn)氣袋中，弄好指示劑以及放好產(chǎn)氣包，36℃正置培養24h，然后取出觀(guān)察。
（六）結果討論
通過(guò)實(shí)驗發(fā)現，覆蓋了培養基的產(chǎn)氣莢膜梭菌為黑色，沒(méi)有覆蓋的則不變黑，另外TSC比SPS上菌數量更多。也更黑，隨著(zhù)時(shí)間的推移，TSC上菌變大速度比SPS更快，所以皿更黑。超過(guò)24h后如果菌較多則會(huì )有部分交替蔓延，不易記數，有時(shí)候SPS上菌還會(huì )不黑呈現灰白色。
TSC培養基上產(chǎn)氣莢膜梭菌樣子（傾倒法，表面覆蓋培養基后）（高稀釋度，低稀釋度）： 黑色明顯，且24h較大，建議20h開(kāi)始計數。
SPS上菌落樣子（傾倒法，表面覆蓋培養基后）（高稀釋度，低稀釋度）：灰黑色，黑色不明顯
后續各種生化驗證實(shí)驗（動(dòng)力試驗，鏡檢，硝酸鹽還原，暴烈發(fā)酵，，乳糖明膠試驗，卵磷脂分解試驗等）。由于本次菌為已知標準菌株，所以驗證就變成了驗證培養基性能了。
6.一些后續實(shí)驗及經(jīng)驗總結
分享多次試驗后獲取的一些經(jīng)驗（其實(shí)都是拿失敗換來(lái)的）。
（1）革蘭氏染色的一些圖片分享
革蘭氏染色試劑套裝@青島海博
染色片
染色要點(diǎn)
沖洗后的染色片
（1）含鐵牛奶培養基暴烈發(fā)酵試驗。最好用18*180的管子，因為產(chǎn)氣能沖很高，真的很劇烈。
發(fā)酵過(guò)后的圖片分享（這還是相對比較溫和的時(shí)候，時(shí)間越長(cháng)，菌初始量越多越?jīng)坝�。�?/span>
（2）卵黃瓊脂培養試驗。這個(gè)是用來(lái)做卵磷脂酶試驗的，從FTG中挑菌液有時(shí)候需要往下和多挑一些，因為我開(kāi)始從皿上接種過(guò)去以及從FTG里取1環(huán)，結果皿上接過(guò)去的菌長(cháng)了，也有現象了（乳白色渾濁）。而FTG里挑的菌液沒(méi)發(fā)生現象。后來(lái)多挑一些菌液現象就出現了，所以這里挑菌液時(shí)候要往下點(diǎn)并且多挑一點(diǎn)點(diǎn)。
（3）厭氧條件的模擬和比較。
我們實(shí)驗室微生物實(shí)驗設備相對比較齊全，加上個(gè)人對微生物學(xué)有極其濃厚的興趣，所以后續進(jìn)行了厭氧操作箱，厭氧盒，三氣培養箱和厭氧產(chǎn)氣袋的實(shí)驗比較。然后發(fā)現了4種培養方式有所不同，為了推薦后來(lái)人做實(shí)驗需要，特寫(xiě)一下各自?xún)?yōu)劣。
目前厭氧培養方式有厭氧盒、厭氧罐、厭氧袋+厭氧產(chǎn)氣袋等方法。厭氧袋+厭氧產(chǎn)氣袋法應用最普遍，適合量大實(shí)驗，有價(jià)廉物美的特點(diǎn)。厭氧盒+厭氧產(chǎn)氣袋法也不錯，用盒代替了厭氧袋。厭氧罐抽氣換氣法：需要配備抽氣換氣裝置；厭氧手套箱：比較昂貴。
首選厭氧盒，因為只做這個(gè)實(shí)驗的話(huà)，厭氧盒密封性較好，能較長(cháng)時(shí)間的維持厭氧環(huán)境。缺點(diǎn)是貴了一點(diǎn)。在我們國情之下，厭氧盒和對應的進(jìn)口產(chǎn)氣包還是相對比較貴的。尤其有大量實(shí)驗時(shí)，需要買(mǎi)數個(gè)厭氧盒，估計提出申請購買(mǎi)時(shí)老板早抽你了。
其次厭氧產(chǎn)氣袋，質(zhì)量方面比厭氧盒要次一點(diǎn)，因為是軟包裝，就像香煙一樣，軟包裝總比硬盒子要低一個(gè)檔次一樣，但是好處是量大實(shí)惠，好用不貴。所以應付大量實(shí)驗時(shí)更合適。
厭氧操作箱，方便安全，和厭氧盒一樣，需要購買(mǎi)設備，如果同時(shí)開(kāi)展多個(gè)厭氧檢測項目，可考慮購買(mǎi)。如果厭氧項目較少，買(mǎi)設備就不那么經(jīng)濟了。也就是說(shuō)東西很好，有錢(qián)就上。
三氣培養箱，我不知道別家三氣培養箱什么情況，我家的三氣培養箱氧濃度最低最低只能達到2%，下不去了。所以做不到嚴格厭氧，長(cháng)產(chǎn)氣莢膜梭菌沒(méi)問(wèn)題，但陰性菌艱難梭菌就長(cháng)不起來(lái)了。
（4）動(dòng)力-硝酸鹽實(shí)驗結果圖片分享。
現象很明顯：無(wú)動(dòng)力，沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)；硝酸鹽還原，滴加硝酸鹽還原試劑（現用現配）后很快（幾分鐘內）顯紅色。
7.方法的不足之處
經(jīng)過(guò)反復實(shí)驗以及查閱文獻和參考老師們的培訓，總結出GB 8538-2016國標方法的幾點(diǎn)不足：
（一）SPS培養效果和菌的回收率沒(méi)有TSC高，也就是說(shuō)SPS培養基不如TSC。實(shí)際檢測數量就會(huì )變少。
（二）傾注平板法沒(méi)有提及覆蓋的問(wèn)題，如無(wú)覆蓋，菌為淺黃或發(fā)白顏色，不變黑。如果檢測實(shí)際樣品就可能造成漏檢。
（1）無(wú)覆蓋，劃線(xiàn)分離法，36℃厭氧，24h。產(chǎn)氣莢膜梭菌劃線(xiàn)在SPS平板上基本無(wú)黑色菌落。
（1）無(wú)覆蓋，劃線(xiàn)分離法，36℃厭氧，24h。產(chǎn)氣莢膜梭菌劃線(xiàn)在TSC平板上有少部分黑色菌落。
（2）有覆蓋，傾注平板法，36℃厭氧，24h。產(chǎn)氣莢膜梭菌傾注 SPS 平板，覆蓋后，絕大多數是黑色菌落。
注意“產(chǎn)氣莢膜梭菌傾注SPS平板覆蓋后”培養的圖片，中間有手指狀一個(gè)黑色區域，那是因為傾注前菌已經(jīng)加了許久，造成再怎么用力已經(jīng)無(wú)法把菌全部混散，這是平板計數法時(shí)候大家要注意的問(wèn)題，特意選擇這張圖以示說(shuō)明和告誡：加完菌液就要混勻，且力量要適當，否則容易沉底、蔓延、成坨。
（2）有覆蓋，傾注平板法，36℃厭氧，24h。產(chǎn)氣莢膜梭菌傾注TSC平板，覆蓋后，絕大多數是黑色菌落。
從SPS和TSC平板比較來(lái)看，相同濃度菌液，產(chǎn)氣莢膜梭菌再TSC上生長(cháng)要比SPS更黑（上圖2個(gè)就是同一稀釋度下平皿，多次實(shí)驗均如此），另一方面 TSC 上菌的數量可能比SPS 多一些（這一點(diǎn)還需自己和實(shí)驗的同仁繼續多做實(shí)驗來(lái)驗證。目前實(shí)驗次數不夠多，不能妄下結論），但有一點(diǎn)可以肯定也已經(jīng)被大家寫(xiě)進(jìn)文章發(fā)表了，那就是覆蓋更能選擇出黑色菌落，不覆蓋單純從顏色來(lái)選擇菌落會(huì )漏檢甚至檢不到。
（三）含鐵牛奶培養基配制描述信息過(guò)少，使用新鮮全脂牛奶加硫酸亞鐵配制，滅菌條件設為115℃，5min為宜，放置在滅菌鍋中央為好。滅完盡快取出冷卻。
（四）GB 8538-2016中選擇卵磷酸酶實(shí)驗并不完全夠用。
三月底在北京實(shí)驗助手舉辦的培訓課上，聽(tīng)了何艷玲老師培訓課，何老師說(shuō)“乳糖-明膠試驗”代替“卵磷脂分解試驗”的原因：部分巴氏梭菌（C.baratii）在含鐵牛奶培養基中也呈現“暴烈發(fā)酵”現象，但可以用乳糖明膠試驗加以區分；另外一些產(chǎn)氣莢膜梭菌卵磷脂酶能力較弱，可能會(huì )造成假陰性，受益良多。
（五）產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)酵葡萄糖，乳糖，麥芽糖，和蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，這個(gè)菌雖厭氧，但不是苛性的，這幾點(diǎn)需要注意，在大腸菌群實(shí)驗初發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，復發(fā)酵不產(chǎn)酸產(chǎn)氣時(shí)就有是產(chǎn)氣莢膜梭菌在搞事情，不妨再按照產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法檢測一下，就當練習一下技巧吧。
8.后記
為什么想寫(xiě)這個(gè)文章，因前一段時(shí)間我們單位擴項，增加了GB 8538-2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》58產(chǎn)氣莢膜梭菌的項目，同時(shí)由于之前接觸較少，在方法驗證時(shí)走了不少彎路， 同時(shí)也“浪費”了一些時(shí)間（福禍相依的道理，彎路也有好處，可以把這個(gè)方法和這個(gè)菌弄的更明白一些）。后查閱文獻和利用自己所學(xué)的微生物學(xué)知識進(jìn)行了一些實(shí)驗摸索，一部分弄明白了，一部分和標準不一致的地方也克服困難跨越過(guò)去了，獲得的一些心得體會(huì )。今年3月份有幸受實(shí)驗助手之邀，獲得了參加其和檢科院合辦的3月份“北京食品安全國家標準微生物學(xué)檢驗技術(shù)高級學(xué)習班”的培訓學(xué)習，再次見(jiàn)到了崇拜的野獸老師、初次見(jiàn)到了檢科院的何老師，聽(tīng)他們二人分別講解產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗（野獸老師講GB 8538-2016.58 產(chǎn)氣莢膜梭菌，何老師講解 GB 4789.13-2012 的產(chǎn)氣莢膜梭菌 ），發(fā)現自己的摸索獲得的一些教訓、經(jīng)驗、觀(guān)點(diǎn)和他們很多地方不謀而合。一時(shí)間相見(jiàn)恨晚，說(shuō)明有條件時(shí)候去參加培訓很有必要，另一方面也證明自己的工作沒(méi)有白干，自我探索精神也很重要。
弄明白了2個(gè)方法里面產(chǎn)氣莢膜梭菌的實(shí)驗方法以及其優(yōu)劣和標準的一些暗坑。特意寫(xiě)出來(lái)分享給大家，讓大家能夠在進(jìn)行這個(gè)實(shí)驗項目時(shí)不至于掉坑里，讓廣大一線(xiàn)微生物檢測員能夠在技術(shù)水平上走的更遠。讓檢測數據更準確可靠。熟練掌握一門(mén)實(shí)驗技術(shù)，有時(shí)候可以自我陶醉一下的，往大了說(shuō)，微生物檢測員就是食品安全的戰士，站好崗可以讓人民生活更有保障（至少檢測合格了不擔心吃壞肚子）。
