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口腔支原體（ATCC23714）和肺炎支原體（ATCC15531）的活化保種過(guò)程，通過(guò)學(xué)習和比較，總結了其中的一些注意事項；同時(shí)對中國藥典和歐美藥典在支原體培養上的一些差異進(jìn)行比較，來(lái)和大家分享一下，互相學(xué)習，共同進(jìn)步。
支原體活化和保種01 準備
這準備，是指整個(gè)實(shí)驗開(kāi)展前的學(xué)習準備。
因為0代的口腔支原體（ATCC 23714）和肺炎支原體（ATCC 15531）只能從ATCC購買(mǎi)，如果是第一次購買(mǎi)并嘗試活化凍干支原體，那么把ATCC關(guān)于這兩株菌的產(chǎn)品說(shuō)明、檢驗報告、SDS等，甚至包括ATCC細菌學(xué)指南《ATCC Bacteriology_Guide》、2015版《中國藥典》三部 3301《支原體檢查法》、USP34 63《支原體檢查法》、EP8.0《2.6.7. MYCOPLASMAS》等資料通讀一遍是十分有必要的。
甚至還可以下載幾本書(shū)，例如《支原體學(xué)》第2版、《支原體-醫學(xué)微生物學(xué)》、《支原體與支原體病》等了解下支原體的一些基本情況。
在這一階段最好能確定好活化凍干支原體的具體操作方法，然后去按方法去操作。
比如說(shuō)：
是采用中國藥典的支原體肉湯培養基和精氨酸支原體肉湯培養基，還是采用ATCC指定的ATCC 2611 培養基和ATCC 243培養基？
是采用甘油保藏法、還是直接分裝法、還是凍干法進(jìn)行保種呢？
在購買(mǎi)前先制定好計劃，可以避免反復下單購買(mǎi)培養基或試劑，省時(shí)省力，有效避免遺漏。
02 購買(mǎi)
ATCC口腔支原體和肺炎支原體
確定好了，就可以下單進(jìn)行購買(mǎi)。
為了讓大家更好的了解差異，本次比較，同時(shí)采用了中國藥典的配方培養基和ATCC指定的培養基進(jìn)行活化。
因為只有采用ATCC的配方培養基，后續如果出問(wèn)題，ATCC才會(huì )承認。但是ATCC的配方培養基成分比較復雜，一些成分要從國外采購，耗時(shí)費力，考慮到長(cháng)期使用的方便性，故中國藥典的培養基一并使用，兩家進(jìn)行比較，如果并無(wú)差別，后續就可直接采用中國藥典的培養基。
建議初次活化的人，也同時(shí)使用兩家的培養基，以確認中國藥典的培養基適用性，這樣后續就可以直接使用中國藥典的培養基。
很不幸的是，在我們的這次比較當中，中國藥典的相關(guān)培養基促支原體生長(cháng)的能力比ATCC的配方培養基要差。
可以看出，ATCC的相關(guān)培養基成分要更復雜，營(yíng)養成分更豐富的。并且EP、USP的支原體章節對培養基配方中腦心浸液等以液體形式加入培養基的混合性生物原材料的主要成分含量做了明確的規定。
《中國藥典》支原體培養基配方中對以液體形式加入豬胃消化液和牛肉浸液，并未對兩者的配方和制法作出更明確的規定。（參見(jiàn)不同來(lái)源藥品支原體檢查用培養基的促生長(cháng)能力研究_趙宏大）。這就是造成國產(chǎn)商品化培養基質(zhì)量參差不齊的不確定因素。從世界范圍來(lái)講，《中國藥典》支原體培養基是屬于“小眾”產(chǎn)品。
注意：如果采用ATCC的相關(guān)培養基，其中像酪蛋白胰蛋白酶消化液、明膠胰臟消化液、馬血清、10X CMRL 1066培養基、酵母提取物等配方中有些添加物是不對國內出售的，要和ATCC咨詢(xún)替代產(chǎn)品，提早訂購，免得耗時(shí)太久。
03 活化
根據ATCC的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，步驟總結如下：
a. 按照隨附說(shuō)明打開(kāi)小瓶。
b. 使用1ml移液器，移取0.5ml規定的肉湯培養基水化凍干粉。并混勻。
c.通過(guò)從原始管中轉移0.25mL至含有2.5mL的管進(jìn)行連續稀釋。稀釋是重要的，可保持支原體培養處于不同的生長(cháng)階段。一旦達到酸性或堿性條件，許多菌株將迅速消亡。
d. 液體培養基在密閉容器內培養，使用未接種的肉湯管作為陰性對照。
e. 可以接種平板以檢查菌落形態(tài)。在37℃ 5％CO2中生長(cháng)。固體培養基在微需養中培養，并保持充足濕度，防止瓊脂表面干燥。
f. 口腔支原體接種到液體培養基里，在48到72小時(shí)內，在前幾個(gè)稀釋管中會(huì )出現中等到輕度的混濁。固體培養基上出現菌落需要更長(cháng)培養時(shí)間。肺炎支原體菌株生長(cháng)更緩慢，并且產(chǎn)生非常輕的濁度�？筛鶕伾兓瘉�(lái)決定何時(shí)終止培養。從紅色到橙色到黃色的指標變化很容易識別。當培養基為橙色時(shí)，支原體最好轉移傳代。變?yōu)辄S色后，支原體已經(jīng)開(kāi)始死亡。
肺炎支原體各個(gè)培養階段顏色變化
口腔支原體和肺炎支原體的菌落鏡檢圖
支原體煎蛋型菌落實(shí)物圖
支原體菌落結構圖
“支原體由于缺少細胞壁，所以在固體培養基上會(huì )形成特殊的“油煎蛋”狀，其中“蛋黃”部分是支原體向培養基內部生長(cháng)的結果，“蛋清”部分是支原體在培養基表面生長(cháng)形成的。在同一視野下區分支原體、細胞殘渣、氣泡對檢定人員對支原體形態(tài)的辨識度要求較高，細胞殘渣在固體培養基上沒(méi)有均一的形態(tài)，邊緣不整齊。而氣泡在鏡下觀(guān)察則中心部分由于透光率高，鏡下觀(guān)察中心明亮，四周較暗。只有很好的區分出三者的區別才能在檢測中減少誤判、錯判的概率。
培養時(shí)間、培養基成分對支原體在固體培養上的形態(tài)也有一定影響。一般支原體在固體培養基中培養2 ～ 3 天后才能在鏡下觀(guān)察到“油煎蛋”形態(tài)，且從第2 天起支原體向四周生長(cháng)的速度明顯加快，鏡下菌體大小變化明顯，7 天后菌體向四周生長(cháng)的速度減慢但仍向培養基內部生長(cháng)，菌體顏色逐漸加深、變暗，邊緣由平滑變得粗糙不規整，菌體開(kāi)始老化�！�
——易致污染的支原體在固體培養基上的形態(tài)特征 傅元欣
04 保種
保種方法有很多種，據說(shuō)液氮儲存是最好的方法，不過(guò)條件受限。一般，也可采用直接分裝保存含支原體的培養基；在-20℃下保存，一般保存期限為1-3年；10%甘油保存法，在-80℃冷凍下，支原體可保存約4年；支原體凍干保存，在2-8℃下，可無(wú)期限保存。建議采用10%甘油保存法，有條件的采用凍干法。
10%甘油保存法：支原體生長(cháng)后，將處于含對數期的支原體的培養基高速離心收集，肺炎支原體建議9000rpm離心30分鐘，口腔支原體自己評估。倒去上清液，再懸浮于適量相應的新鮮肉湯培養基中。加入等量的20%甘油，甘油終濃度為10%。20%甘油可以高溫滅菌，也可過(guò)濾除菌。
凍干法：支原體生長(cháng)后，將處于含對數期的支原體的培養基高速離心收集，倒去上清液，再懸浮于適量相應的新鮮肉湯培養基中。加入等量的ATCC培養基9520（ATCC培養基9520為10％BSA和20％蔗糖的混合物，過(guò)濾除菌既得）中懸浮并徹底混合。取適量懸浮液分配到每個(gè)安瓿瓶中。放入凍干機內進(jìn)行凍干。凍干程序可參考《ATCC細菌學(xué)指南》相關(guān)規定。
支原體凍干粉
中國藥典和歐美藥典差異
通過(guò)對比可以看出，中國藥典在支原體培養法中和歐美藥典的差異、甚至可以說(shuō)是不足，這是十分值得思考和總結的。
例如：
①CP所用培養基促支原體生長(cháng)能力偏弱；
②CP沒(méi)有規定支原體的培養條件中需氧量；
③CP沒(méi)有限定支原體的傳代次數；
④CP在支原體檢查第一法中，并沒(méi)有要求同步做陽(yáng)性對照和陰性對照；
⑤CP僅憑肉湯顏色變化，便判斷有無(wú)支原體并不夠嚴謹，顏色的變化是有多種可能原因的，有可能是微生物污染，導致培養基pH變化，導致酚紅指示劑顏色的變化。在判標上，歐美都要求將肉湯再次接種到平板上通過(guò)菌落判斷。
中美藥典的這些差異，給企業(yè)在實(shí)際操作過(guò)程中帶來(lái)了不小的困惑和不確定性。因此，建議下一版《中國藥典》在修訂時(shí)，將培養條件、液體培養基及固體培養基具體的培養方法以及增加觀(guān)察菌落來(lái)判斷等內容都能進(jìn)一步明確，減少企業(yè)在實(shí)際操作過(guò)程中的困惑。
參考資料
1、ATCC23714口腔支原體和ATCC15531肺炎支原體產(chǎn)品說(shuō)明、檢驗報告
2、ATCC細菌學(xué)指南《ATCC Bacteriology_Guide》
3、2015《中國藥典》三部3301 支原體檢查法
4、USP 《63支原體檢查法》、
5、EP《2.6.7. MYCOPLASMAS》
6、《支原體學(xué)》第2版
7、《支原體-醫學(xué)微生物學(xué)》
8、《支原體與支原體病》
9、淺談國內支原體培養和鑒定中存在的問(wèn)題_趙旺勝
10、支原體檢查試驗培養條件考察_趙宏大
11、易致污染的支原體在固體培養基上的形態(tài)特征_傅元欣-
12、中國藥典與歐美藥典對支原體檢查培養基規定的差異
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