大腸菌群平板計數法常見(jiàn)問(wèn)題

1、VRBA培養相關(guān)問(wèn)題
（1）所用器皿是否需要滅菌？
答：不需要。配制培養基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌，但要求一定要清洗干凈，表面無(wú)污漬、無(wú)殘留。煮沸完成后，取下錐形瓶，用一般常用的衛生紙（軟紙）覆蓋瓶口，用橡皮筋纏繞，待冷卻至適宜溫度即可傾注培養基。在傾注培養基時(shí)，須點(diǎn)燃酒精燈，稍微灼燒錐形瓶口。
（2）如何保持“煮沸2min”？
答：可以用電磁爐或電熱板進(jìn)行加熱煮沸，在該培養基即將煮沸時(shí)調低溫度。實(shí)際操作時(shí)，不需要嚴格按照此要求進(jìn)行，加熱煮沸數秒即可。原因：本培養基很難保持煮沸2min，一旦煮沸，則培養基很快上涌、翻騰，若不調低溫度或立刻采取其他措施，則培養基可在數秒內噴涌出來(lái)，嚴重者可噴涌2米以上、電磁爐周?chē)?—2米范圍內都是培養基飛濺的范圍（實(shí)驗室危險因子之一）。
（3）若培養基未用完，是否可以冷藏起來(lái)下次用？
答：不可以。4789.28中已規定，固體培養基最多允許熔融1次（指的是經(jīng)過(guò)高壓滅菌冷卻后的培養基還可以熔融一次后使用）。且VRBA培養基冷卻后，再次熔融時(shí)非常容易噴涌，若溫度控制不當，底部培養基熔融后很快就會(huì )發(fā)生噴涌（即培養基未完全熔融就會(huì )發(fā)生噴涌現象）。
（4）傾注完成后是否需要“覆蓋一層”？如何覆蓋？
答：一般情況下不需要覆蓋。在實(shí)際操作過(guò)程中，若檢驗員初次接觸該食品（或食品品類(lèi)），則有必要在傾注培養基后再覆蓋一層（原因是不清楚該樣品是否會(huì )發(fā)生蔓延）。而如此往復測試幾次后，若該樣品或食品品類(lèi)均不存在蔓延現象，則以后的實(shí)驗中都不需要進(jìn)行覆蓋。若重復多次測試后都有蔓延現象，則以后的檢驗中最好都進(jìn)行覆蓋，最好是在原培養基已凝固或半凝固（不會(huì )發(fā)生晃動(dòng)）時(shí)再傾注一層培養基（“一層”是指緩慢傾注培養基至培養基剛好能夠覆蓋整個(gè)平皿）。

2、如何確定培養基上長(cháng)的是不是大腸菌群？
答：建議新手們認真按照標準進(jìn)行證實(shí)試驗，此證實(shí)試驗簡(jiǎn)單易操作，每一次VRBA上有菌落生長(cháng)都進(jìn)行證實(shí)試驗，如此往復3-4次，對于哪種形態(tài)才是大腸菌群已經(jīng)能夠了然于心。

3、兩個(gè)梯度都長(cháng)了菌，如何選��？
答：選取15-150CFU之間的平板（指的是VRBA平板上所有菌落數在此范圍），挑取可疑菌落進(jìn)行證實(shí)試驗。詳細舉例說(shuō)明：若有兩個(gè)連續梯度的4個(gè)平板上菌落數均在15-150之間，則4個(gè)平板上的菌落都要挑取進(jìn)行證實(shí)試驗，實(shí)際操作時(shí)，可靈活操作，如：1:10的兩個(gè)平板上的菌落數分別為120、123，1:100的兩個(gè)平板的菌落數分別為16、18，嚴格來(lái)講必須至少在每個(gè)平板上分別挑取5個(gè)可疑菌落、5個(gè)典型菌落進(jìn)行證實(shí)試驗，如此需要40根GBLB肉湯管。建議使用鎳合金接種環(huán)（即傳統的接種環(huán)，而不是一次性塑料接種環(huán)），因為VRBA上生長(cháng)的菌落（無(wú)論典型或可疑）大部分長(cháng)在底層、且菌落一般較大，被培養基覆蓋，傳統的接種環(huán)較細，用以刮去上層培養基較方便，挑取菌落也較方便。

4、如何進(jìn)行證實(shí)試驗？菌落選取數量？
答：同上所述，建議新手們VRBA上的所有不同形態(tài)的菌落都進(jìn)行證實(shí)試驗。每種不同形態(tài)都挑取5-10個(gè)進(jìn)行證實(shí)試驗（若BGLB管足夠，建議多挑取幾個(gè)進(jìn)行試驗）。
注意：A.每種可疑菌落挑取5個(gè)，每個(gè)菌落放入1管GBLB管中；B.“產(chǎn)氣者，記為大腸菌群陽(yáng)性管”，就要求在實(shí)驗前須認真篩選BGLB管，凡產(chǎn)氣的GBLB管應棄去不用。

5、結果如何計算？
答：首先，在VRBA培養24h后進(jìn)行計數，分別計數可疑大腸菌群和典型大腸菌群（何為可疑、何為典型？同“2”，檢驗員多進(jìn)行幾次實(shí)驗后自然很清楚典型的大腸菌群是何種形態(tài)）的數量。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個(gè)，典型大腸菌群有6個(gè)；其次，進(jìn)行證實(shí)試驗，挑取上述可疑和典型大腸菌群各5個(gè)（或者全部挑�。�，假如10個(gè)可疑大腸菌群中有3個(gè)證實(shí)為陽(yáng)性，6個(gè)典型大腸菌群中有5個(gè)證實(shí)為陽(yáng)性，則計算方法如下：最終大腸菌群數=經(jīng)證實(shí)的大腸菌群數=可疑大腸菌群經(jīng)證實(shí)的數量+典型大腸菌群經(jīng)證實(shí)的數量=10×（6/10）×10+6×（5/6）×10=110。

6、若平板上很多菌落，最終證實(shí)全部為陰性，結果如何計算？
答：根據第3條,選取適宜菌落數的平板挑取菌落進(jìn)行證實(shí)試驗，若證實(shí)全部為陰性，則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落（建議可疑和典型菌落分別挑取10個(gè)）進(jìn)行證實(shí)試驗，若第二次證實(shí)試驗均呈陰性，以＜1乘以最低稀釋度進(jìn)行計算，如：1:10的平板菌落數分別為120、123，1:100的平板上菌落數分別為16、18，首先挑取1:100的兩個(gè)平板上的菌落進(jìn)行證實(shí)試驗，若全部為陰性，再挑取1:10的兩個(gè)平板上的菌落進(jìn)行證實(shí)試驗，若1:10的平板上的菌落數證實(shí)為陰性，則最終計算過(guò)程為＜1x10，最終結果為＜10；若1:10的的平板上的菌落有陽(yáng)性管，則按照第5條進(jìn)行計算。

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