如何正確制備微生物檢測培養基？

一、稱(chēng)取

    用精確度1/100的電子天平稱(chēng)取培養基所需藥品。先根據配方計算出配制一定量培養基所需各種成分藥品的量，然后用天平準確稱(chēng)取。稱(chēng)量時(shí)用稱(chēng)量紙折疊成簸箕狀盛放藥品。稱(chēng)量紙折疊方法如圖所示。

圖1 培養基的稱(chēng)量

圖2 稱(chēng)量紙的折法

二、溶化

    培養基放入燒杯或搪瓷缸中，慢慢加入少量所需水，邊加入邊用玻棒攪拌。如果培養基中不含有瓊脂，培養基不需要加熱；如果含有瓊脂，則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸，完全溶解后，再補齊所需水，并攪拌均勻（如圖3所示）。如果配制的培養基量很大，可用不銹鋼鍋加熱溶化，可先用溫水加熱并隨時(shí)攪動(dòng)，防止焦化，如有焦化現象，配制的培養基就不能使用，要重新配制。

    配制培養基時(shí)不可用銅或鐵的容器溶化，因銅或鐵制容器可能會(huì )使培養基中的銅和鐵的含量超標，影響實(shí)驗（培養基中銅含量大于0.3mg/L，細菌不宜生長(cháng)，鐵含量超過(guò)0.14mg/L，妨礙細菌產(chǎn)毒素）。對容易發(fā)生反應，產(chǎn)生沉淀的藥品，要分開(kāi)溶解，最后加入培養基，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂。

圖3 培養基的融化

三、調pH

    雖然培養基中含有緩沖物質(zhì)成分，能使培養基的pH盡可能的保持在要求的范圍內，但是配出的培養基若不符合要求，就要進(jìn)行必要的調整。如果有已校準pH計，可用pH計，如果沒(méi)有，可用精密的pH試紙，再根據需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸（微調可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸）調制所需的pH。培基的pH一般為7.4～7.6，也有酸性或堿性的。用氫氧化鈉調整的需要高壓滅菌的培養基，在調整pH時(shí)要調至高出所需0.1個(gè)～0.2個(gè)單位，因用氫氧化鈉調整時(shí)，高壓滅菌后，培養基的pH要降低0.1~0.2。如培養基中含有碳酸鈣成分，可不pH。

圖4 用pH計稱(chēng)量培養基的pH

四、過(guò)濾

    配成的培養基，若無(wú)特殊要求，可省略此步。若有沉淀或渾濁．需要澄清的．液體培養基可用油紙過(guò)濾。而固體培養基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過(guò)濾。如果過(guò)濾法還不能達到澄清的要求，則可用蛋清澄清法，即培養基加熱冷卻到50~60℃，裝入三角瓶?jì)龋ú怀�過(guò)容量的二分之一），按1000mL加人1個(gè)～2個(gè)雞蛋的蛋清，用力搖晃3-5min，高壓蒸汽滅菌121℃、20min，取出趁熱過(guò)濾即可。

五、分裝

    配制好的培養基根據不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中，分裝試管，如果試管量很大，可用自動(dòng)分液器，如果試管量少，可用漏斗分裝。分裝量不超過(guò)容器容積的三分之二。三角瓶以不超過(guò)容積的二分之一為宜；瓊脂斜面以不超過(guò)試管長(cháng)度的五分之一為宜，滅菌后，擺成的斜面為培養基量的三分之一，底層為三分之二的量為宜；半固體瓊脂分裝量為試管長(cháng)度的三分之一；用來(lái)接種或保菌的高層瓊脂，分裝量為試管長(cháng)度的四分之一或三分之一，用來(lái)接種厭氧菌的要達到三分之二；瓊脂平板，內徑為90mm的以13mL~15 mL為宜，內徑70mm的平板為8mL~10 mL，制成的瓊脂平板若表面水分較多，可將平板倒扣，放置在37℃培養箱內30min，干燥后再用。每批培養基應另外分裝一小玻璃瓶（約20mL）與該批培養基同時(shí)滅菌，為測定該批培養基最終pH。

圖5 自動(dòng)分液器分裝試管

六、滅菌

    分裝好的培養基應立即進(jìn)行滅菌。滅菌的方法種類(lèi)如下：

    1.高壓蒸汽滅菌法

    大多耐熱培養基都可用此法，小量分裝時(shí)，用121℃，15min；滅菌量大時(shí)，用121℃，30min滅菌；含糖類(lèi)的培養基只能113~115℃，15min滅菌，避免糖類(lèi)遭破壞。

    2.煮沸滅菌法

    對含有不耐高溫物質(zhì)的培養基，可使用此方法。

    3.過(guò)濾除菌

    以過(guò)濾的方法除菌，用無(wú)菌操作技術(shù)，定量加入培養基。血液、抗生素可用無(wú)菌操作技術(shù)抽取，加入冷卻到50℃左右的培養基中。培養基含有不耐熱的物質(zhì)時(shí)，可用此法。

    對LST培養基進(jìn)行滅菌時(shí)，有時(shí)發(fā)酵管內會(huì )有氣泡。為防止發(fā)酵管內產(chǎn)生氣泡，可以采取以下幾項措施：

    1. 小倒管浸滿(mǎn)培養基（不留氣泡）后再加入到盛LST的試管中。

    2.滅菌鍋關(guān)閉放氣閥前，將鍋內氣體排干凈。

    3.試管塞不要塞得太緊（使用硅膠塞的時(shí)候），勿使用橡皮塞。

    4.不要過(guò)早打開(kāi)滅菌鍋，要等滅菌鍋內氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時(shí)再打開(kāi)滅菌鍋。

如果以上情況都做到還有氣泡，可用水做培養基組的對照試驗，若培養基組有氣泡，而對照組沒(méi)有氣泡可確定是培養基自身的原因。

七、倒平板

    滅菌融化的培養基冷卻到50℃后，倒入無(wú)菌干燥的培養皿中。培養基的溫度不能過(guò)高，否則容易在培養皿的內蓋上形成太多的冷凝水；溫度太低，培養基又容易凝固成塊，無(wú)法制成平板。倒平板時(shí)，應在靠近酒精燈火焰進(jìn)行，以免外界的雜菌落入平板內，左手拿培養皿，右手拿三角瓶的底部，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下，灼燒瓶口，用大拇指和食指把培養皿蓋打開(kāi)一條縫，至瓶口剛好伸入，倒入培養基，以鋪滿(mǎn)底為限，不超過(guò)培養皿高度的三分之一，迅速蓋好蓋，放在桌面上，輕輕地轉動(dòng)培養皿，使培養基分布均勻，冷凝后即可。

八、擺斜面

    裝在試管中的瓊脂培養基，在滅菌完成后，趁熱立即擺放在木棒（或玻璃棒）上，并成適當的斜度，冷卻后，瓊脂凝固即成斜面。斜面長(cháng)度不用超過(guò)試管二分之一。 

九、質(zhì)量檢查

    培養基滅菌后仔細檢查一遍，發(fā)現有破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養基沾染，都要丟棄，不能再用。并測定其最終pH。還需進(jìn)行無(wú)菌檢查和效果檢查。無(wú)菌檢查是將滅菌后的培養基取1管（瓶）~2管（瓶），37℃恒溫培養1d～2d，確定無(wú)雜菌生長(cháng)；效果檢查是用標準菌株接種在相關(guān)的培養基上檢查檢查菌的生長(cháng)、形態(tài)及生化情況，與已知情況相符。兩種情況都合格，配制的培養基方可使用。

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