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仔豬腹瀉是困擾規�；B豬生產(chǎn)的主要難題之一，致病性大腸桿菌是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最重要的病原，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic escherichia coil，etec）是最主要的致病菌（morris等，1985；楊正時(shí)，1987；yokayama等，1992；alexander,1994；hampson，1994）。bergland（1980）報道，從斷乳前腹瀉仔豬中分離到etec的機率為45.6%，其頻度比豬球蟲(chóng)(23%)和輪狀病毒(20.9%)感染的總和還多。alexander（1994）發(fā)現，由etec引起仔豬斷奶前腹瀉而造成的死亡率占仔豬死亡率的11％。同年，hampson等另一項調查認為etec造成的仔豬斷奶后腹瀉平均每年就造成1.5%～2%的斷奶仔豬死亡。王紅寧等（1999）在1995～1999年間對四川等地規�；i場(chǎng)的流行病學(xué)調查發(fā)現，由etec引起的仔豬黃、白痢的發(fā)生率達20％～60％，混合感染死亡率可達60％以上。
抗生素作為控制細菌感染的有效藥物廣泛應用于生產(chǎn)中，但抗生素的長(cháng)期使用引起的耐藥性問(wèn)題和生產(chǎn)中超量使用抗生素的現象越來(lái)越突出，但控制效果卻并不樂(lè )觀(guān)�？股靥娲返难芯砍蔀樾竽翗I(yè)發(fā)展的迫切需求。
初生仔豬和早期斷奶仔豬自身免疫功能的不成熟以及早期斷奶應激引起的免疫抑制，是造成仔豬對etec敏感性增高、抗病力下降，并引發(fā)etec感染性腹瀉的主要因素。利用外源抗體為仔豬提供被動(dòng)免疫從而預防和治療腸道etec感染引起的疾病的研究將近已有一個(gè)世紀的歷史，并證明了外源性抗體的有效作用。其中，雞卵黃抗體因其化學(xué)性質(zhì)穩定、特異性抗體含量高、安全性好、易規�；a(chǎn)等特點(diǎn)，而越來(lái)越受到人們的注意，并有潛力開(kāi)發(fā)為一類(lèi)可替代抗生素的高效生物防治制劑。近年來(lái)國內外的研究結果也證明，應用卵黃抗體防治由etec引起的仔豬腹瀉，能夠取得比較滿(mǎn)意的效果。
根據抗原的制備方式，預防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的生產(chǎn)方式可以分為兩類(lèi)：一類(lèi)是直接用etec的菌體蛋白作為免疫原，而另一類(lèi)則是將經(jīng)分離純化后的菌毛蛋白作為免疫原。有研究證明，后者免疫獲得的卵黃抗體的應用效果優(yōu)于前者（kim等，1996；肖馳等，1998；marquardt等，1999）。然而，由分離純化后的菌毛抗原制備的卵黃抗體，其成本較高。通過(guò)基因工程技術(shù)，構建高量表達菌毛蛋白的大腸桿菌，為解決這一問(wèn)題提供了有效的手段。本文擬對預防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
1 卵黃抗體的特性及作用機理
自klemperer于1893年首次報道雞蛋中存在抗體以來(lái)，人們對蛋中抗體的研究不斷深入。蛋內的抗體主要存在于蛋黃內，以igg占優(yōu)勢，iga和igm的含量極低（roth，1981；locken，1983）。利用經(jīng)過(guò)特異性免疫的母雞來(lái)生產(chǎn)卵黃抗體，比從哺乳動(dòng)物血液中獲得的抗體具有突出的優(yōu)越性：①易于生產(chǎn)。實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物采血不僅對動(dòng)物本身是極大的應激，且費時(shí)費工。雞產(chǎn)蛋無(wú)傷害性和對佐劑不起像哺乳動(dòng)物中出現的嚴重反應，因而方便得多；②產(chǎn)量高，成本低 。以一只母雞為例，其年產(chǎn)蛋量為200～300枚，每只蛋中約含抗體100～150mg（larsson，1993）；③卵黃抗體穩定性好，耐酸、耐堿、耐熱（losch等，1986；shimizu等，1992；李學(xué)伍，2000），有利于運輸、貯藏。
預防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體對宿主特異性菌毛抗原有強烈的親和力（yutaka，1995），能夠阻斷或降低宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結合，使etec不能在小腸定居繁殖，從而阻斷了大腸桿菌產(chǎn)生腸毒素，防止和減少仔豬腹瀉的發(fā)生（jin等，1998）。
2 預防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體對仔豬腹瀉的效果
盡管預防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體的生產(chǎn)方式不同，其機理都是通過(guò)特異性的卵黃抗體來(lái)阻斷或降低大腸桿菌的宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結合（jin等，1998），使etec不能在小腸定居繁殖和產(chǎn)生腸毒素，從而防止腹瀉的發(fā)生。飼料中添加少量的卵黃抗體，可以顯著(zhù)地降低仔豬腹瀉率，并在一定程度上提高動(dòng)物的增重、飼料轉化率。
一些研究者直接用大腸桿菌菌株免疫產(chǎn)蛋母雞來(lái)獲得卵黃抗體（胡子信，1994；李國平，2002）。李國平等（2002）用etec k88、k99、987p、f41標準菌株制成的滅活油佐劑作為免疫原，待產(chǎn)蛋雞免疫后收集高免卵黃，然后提取、純化，精制成雞抗豬大腸桿菌特異性高免卵黃抗體并用于臨床。結果表明該制劑安全性好，每頭仔豬注射或口服2～4ml劑量，能有效預防仔豬大腸桿菌性腹瀉。而徐福洲等（2002）同樣利用etec標準菌株制備滅活苗,免疫待開(kāi)產(chǎn)母雞，提純卵黃抗體對攻毒仔豬口服治療，結果顯示治療仔豬腹瀉狀況明顯減輕，與對照組相比有顯著(zhù)差異；治療組未出現死亡而對照組仔豬有33%～67%的死亡率。此結果表明，卵黃抗體治療由etec所致的仔豬腹瀉具有明顯的效果。
另外一些研究者則采用分離出純化后的大腸桿菌菌毛蛋白作為免疫原，通過(guò)多次免疫健康的產(chǎn)蛋母雞，從而獲得卵黃抗體。yokoyama（1992）將提純的etec宿主特異性菌k88、k99、987p制成菌毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫產(chǎn)蛋母雞，抗體達到高效價(jià)后，收集雞蛋從蛋黃中分離和噴霧干燥抗體，對不同etec菌株感染的初生未食初乳仔豬用適當的抗體治療。試驗中，所有仔豬接受不同菌株感染后12h內均發(fā)生中度或嚴重腹瀉，用效價(jià)為1：625和1：2 500的抗體治療仔豬全部存活，而對照組超過(guò)80%的仔豬死亡。同時(shí)，他們還研究了從雞蛋卵黃中提取干粉抗體的方法。所提純的卵黃抗體可以用于治療仔豬大腸桿菌腹瀉；使用前的保存和運輸過(guò)程不需低溫，使用方便而且效果比較可靠。yutaka（1992）在飼糧中添加經(jīng)etec k99菌毛蛋白免疫得到的卵黃抗體，當效價(jià)為1：800和1：1 600時(shí)，能夠有效治愈所有腹瀉仔豬，并提高了仔豬的日增重。
本實(shí)驗室用分離提純的特異性菌毛抗原制備抗etec 的卵黃抗體，應用細菌體外粘附試驗研究了卵黃抗體預防仔豬etec感染性腹瀉的機制，并通過(guò)飼養試驗研究了卵黃抗體預防斷奶仔豬腹瀉的效果。結果表明：在體外試驗中，無(wú)抗體的對照組平均每個(gè)上皮細胞黏附16.4個(gè)k88ac；抗體效價(jià)分別為1：640和1：1 280的卵黃抗體較對照組均極顯著(zhù)抑制了k88ac對腸上皮細胞的黏附作用（p<0.01），平均每個(gè)上皮細胞分別僅黏附8.5和2.4個(gè)細菌，二者之間也存在極顯著(zhù)差異（p<0.01）；抗體效價(jià)為1：320的抗體組相對對照組有一定抑制細菌粘附作用，但差異不顯著(zhù)（p＝0.15）。用90頭28日齡斷奶仔豬進(jìn)行了為期4周的飼養試驗。試驗以玉米—豆粕典型日糧為對照組，在對照組日糧中分別添加0.5％、1％、2％的噴霧干燥卵黃粉形成試驗一組、試驗二組和三組的試驗日糧。添加1％卵黃抗體粉顯著(zhù)降低了料肉比和腹瀉率（p<0.05），促進(jìn)了試驗期仔豬的平均日增重（p=0.052）。
kim等(1996)曾分別以etec的k88菌毛和減毒菌株作為抗原制備卵黃抗體，并對其效價(jià)進(jìn)行了比較，結果表明前者免疫得到的卵黃抗體效價(jià)明顯高于后者。為比較由菌毛免疫和菌株免疫兩種不同方法所得卵黃抗體的臨床效果，肖馳等（1998）用這兩種方法制備的卵黃抗體進(jìn)行了臨床預防和治療試驗；結果表明，兩種卵黃抗體均能有效地預防和治療仔豬大腸桿菌性腹瀉；但菌毛蛋白疫苗卵黃抗體的應用效果更好。
此外，部分研究者用多價(jià)菌苗免疫獲得卵黃抗體，用于防治仔豬腹瀉也取得較好的效果，同時(shí)增加了卵黃抗體作用的廣譜性。胡子信等（1994）將引起仔豬嚴重發(fā)病的腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌k88、k99、987p三個(gè)標準菌株，制成大腸桿菌三價(jià)菌苗，免疫接種健康產(chǎn)蛋雞，制成雞抗豬大腸桿菌高免卵黃液，并用以對仔豬大腸桿菌病進(jìn)行預防和治療，其有效率達到100%。李學(xué)伍（2000）等用分離純化后的多價(jià)菌株的菌毛蛋白作為抗原，制備了抗仔豬大腸桿菌性腹瀉的多價(jià)卵黃抗體。經(jīng)試驗證明，該多價(jià)卵黃抗體粉對發(fā)病仔豬的治愈率最高可達97.7%，比藥物治療的治愈率高21.2%。然而，華榮虹等（2002）比較k88、k99、987p、f41單一菌毛免疫與4種菌毛混合免疫母雞的效果發(fā)現，菌毛單獨免疫后卵黃抗體效價(jià)均高于混合菌毛苗免疫后相應卵黃抗體的效價(jià)。
在選擇試驗菌株時(shí)，大部分人選用標準菌株，也有一些研究者選用地方株。如marquardt等（1999）采用地方株etec（k88+）菌毛抗原免疫母雞后獲得卵黃抗體，其對新生和斷奶感染etec的仔豬不僅有保護作用，而且在商業(yè)性豬場(chǎng)用于提前斷奶的仔豬也有效。他們的試驗結果表明，用k88+ e.coli誘導而腹瀉的3日齡仔豬，在用雞蛋抗體后24h被治愈。而用未免疫母雞蛋黃粉處理的，仔豬繼續腹瀉，其中62.5%因嚴重腹瀉而死亡。在21日齡斷奶仔豬的感染試驗中，飼喂蛋黃抗體后有短暫的腹瀉，試驗期間100%存活且體重明顯增加，而對照組則出現嚴重的腹瀉和脫水癥狀，且48h內有仔豬死亡。對豬場(chǎng)14～18日齡的斷奶仔豬的飼喂試驗表明：飼喂含卵黃抗體日糧的仔豬在腹瀉發(fā)生率和嚴重程度上均比飼喂含抗菌素的商品日糧組低。高云英等（2003）應用仔豬大腸桿菌標準菌株和地方分離菌株混合免疫商品蛋雞，收獲高免蛋制備多價(jià)卵黃抗體。經(jīng)預防、攻毒試驗及臨床治療效果觀(guān)察,對仔豬免疫保護率可達90%以上，攻毒保護率98%以上，臨床治愈率95%以上。
3 利用基因工程技術(shù)制備菌毛抗原的研究
過(guò)去的研究中，etec 菌毛蛋白提取純化方法已得到不斷優(yōu)化，而卵黃抗體的生產(chǎn)加工也已逐步工業(yè)化。本實(shí)驗室在前期工作中也已經(jīng)建立了快速準確的etec及其亞型的分子鑒定方法，并研制開(kāi)發(fā)出預防仔豬大腸桿菌性腹瀉卵黃抗體。然而，針對菌毛蛋白表達量少的問(wèn)題，有必要進(jìn)一步研究降低抗原生產(chǎn)成本的技術(shù)。
基因工程的本質(zhì)就是按照人們的設計藍圖，將生物體內控制性狀的基因進(jìn)行優(yōu)化重組，并使其穩定遺傳和表達�；蚬こ碳夹g(shù)利用細菌（如大腸桿菌和酵母菌等）基因表達調控機制相對簡(jiǎn)單和生長(cháng)速度較快等特點(diǎn)，令其超量合成其它生物體內含量極微但卻具有較高經(jīng)濟價(jià)值的生化物質(zhì)。目前，已有100多種異源蛋白通過(guò)大腸桿菌基因工程均實(shí)現了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結構相當復雜的人體蛋白，如富含半胱氨酸殘基的血清白蛋白（has）、尿激酶原（pro-uk）、金屬硫蛋白等（張惠展，2002）。
國內外已有許多研究者在構建etec粘附素抗原的基因工程菌株方面開(kāi)展了工作。mooi fr等（1981）構建了含有k88ab抗原基因的重組質(zhì)粒pfm205，進(jìn)行轉化，獲得的重組菌株能與特異性抗k88ab的抗體結合。dougan 等（1983）構建了含k88ac粘附素抗原的質(zhì)粒pmf005，重組質(zhì)粒依賴(lài)pbr322自身編碼的啟動(dòng)子，能使k88ac粘附素抗原的表達水平升高。此外，這些研究者認為，若 pbr322啟動(dòng)子被編碼色氨酸的啟動(dòng)子取而代之，那么當色氨酸啟動(dòng)子被阻遏時(shí)，重組質(zhì)粒trp-pmk005表達 k88ac粘附素抗原的水平提高（kehoe m等，1983）。后來(lái)，dougan 等（1986）用免疫試驗證明了含重組質(zhì)粒pmk005的工程菌株具有較好的免疫活性，但對于如何解決k88粘附素抗原的高效表達沒(méi)有進(jìn)一步的研究。holoda e和mikula i（1994）曾報道用ptac 啟動(dòng)子代替質(zhì)粒pbr322的p啟動(dòng)子，使k88ab抗原更易在受體菌中表達；且表達量高于k88ab野生型菌株，其中在受體菌e.coli c600中表達量最高，同時(shí)在沙門(mén)氏傷寒菌tm333中的表達水平與e.coli c600相當（holoda e和mikula i，1995）。但對于構建后工程菌株粘附素蛋白表達的穩定性并未進(jìn)行研究。
在國內，洪孟民等（1985）率先研制成etec k88工程菌；而張林元等（1985）用不同的受體菌也構建了不產(chǎn)生腸毒素的k88ac抗原工程菌株。同時(shí)，張景六等（1985）構建了帶有k88和k99兩種菌毛抗原基因的質(zhì)粒，為預防不同菌毛抗原型etec引起的仔豬腹瀉提供了更廣泛的作用。而攜帶此質(zhì)粒的工程菌株合成k99亞基和菌毛的能力略差于僅表達k99菌毛抗原的菌株。隨后，李豐生等（1987）用基因工程技術(shù)構建了含etec k88ac和lt（a-b+）兩種抗原基因的菌株。此菌株的菌毛抗原的表達量與其親本株基本相同。20世紀90年代，吳雅旭等（1991）用強啟動(dòng)子代替載體自身的啟動(dòng)子，結果獲得了菌毛抗原表達效率為原株16倍的etec k88ac抗原基因工程株。然而，研究者發(fā)現該重組子原代細胞于4℃放置數天，或連續傳幾代后，即使在氨卞青霉素抗性培養基上生長(cháng)，表達水平也會(huì )明顯降低�？梢�(jiàn)，其質(zhì)粒不穩定，易丟失。針對這一缺陷的改進(jìn)，將近十年國內都沒(méi)有相關(guān)的研究報道。
可以預見(jiàn)，隨著(zhù)基因工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以及新啟動(dòng)子的不斷出現和dna重組載體/受體系統的多樣化，可以利用基因工程技術(shù)來(lái)構建高效、穩定表達etec菌毛蛋白的菌株，提高菌毛抗原的產(chǎn)量，從而大大降低卵黃抗體成本，促進(jìn)這一替代抗生素新型添加劑的廣泛應用。
