實(shí)驗室無(wú)菌環(huán)境怎樣監控和檢測？

    微生物檢測人員天天都需要在無(wú)菌室工作，在超凈臺或者生物安全柜里操作，為了保證我們檢測的準確性，我們必須要求無(wú)菌室以及工作臺符合要求，那我們應該怎樣進(jìn)行驗證呢？下面我們介紹一下環(huán)境中無(wú)菌或殺菌效果應如何檢查。

一、紫外燈殺菌效果檢查

    紫外燈在使用過(guò)程中輻射強度會(huì )逐漸降低，影響其殺菌效果，故應該定期檢查。紫外燈的殺菌有效波長(cháng)是253.7nm，其強度可以用中心波長(cháng)254nm的紫外線(xiàn)強度計測定。在沒(méi)有紫外線(xiàn)強度計的情況下可以采用生物學(xué)替代。

    生物學(xué)測試簡(jiǎn)要步驟如下：選用枯草芽孢桿菌ATCC 9372，制成106CFU/mL~108CFU/mL濃度的菌懸液；選用經(jīng)脫脂處理的0.5cm×1.0cm大小的布片或鋁片，高壓滅菌后用作載體；每個(gè)載體上滴一滴制備好的菌懸液，干燥后備用；將8個(gè)染菌載體放于無(wú)菌器皿中，置于紫外燈下1m~1.5m處，開(kāi)啟紫外燈照射，于0.5h、1h、1.5h和2h各取出2個(gè)染菌載體，分別投入盛有5mL緩沖蛋白胨水的洗脫液；系列稀釋后進(jìn)行平板計數；同法取8個(gè)染菌載體用做陽(yáng)性對照，操作除不經(jīng)紫外此昂照射外與試驗組相同。

    殺滅率=（陽(yáng)性對照回收菌數-試驗組回收菌數）/陽(yáng)性對照回收菌數×100%

    殺滅率大于99.9%時(shí)，認為紫外燈殺菌效果合格。

二、無(wú)菌室空氣質(zhì)量檢查

    無(wú)菌室空氣質(zhì)量檢查應按照采樣計劃，根據情況對處于空態(tài)、靜態(tài)和正常運行的風(fēng)險區，使用適當的儀器采集空氣中微生物，測定并監控風(fēng)險區空氣的微生物污染�？諝鈶腋∥⑸�物的采樣和計數方法多種多樣，根據多需采樣目的決定具體的采樣方法和采樣器。因采樣器的采集效率不同，應慎重選擇合適的方法和設備。采樣器分為兩類(lèi)：被動(dòng)式采樣器，如落菌盤(pán)；主動(dòng)式采樣器，如過(guò)濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。

1.沉降法

    落菌盤(pán)等被動(dòng)式空氣微生物采樣器不能測量空氣中的微生物的總數，而是測量空氣中微生物在表面的沉降率。只要確定單位時(shí)間落菌盤(pán)上微生物的數量，再根據落菌盤(pán)的暴露面積與暴露時(shí)間之間的關(guān)系，即可大致計算出空氣中微生物的數量。

    面積小于30m2的室內設一條對角線(xiàn)取3點(diǎn)，在其中心以及兩端距墻1m處各取1點(diǎn)；面積大于30m2的室內房間四面距墻1m和中央各放置一個(gè)平皿，高度為實(shí)驗臺高度。培養基平皿開(kāi)蓋暴露10min，然后蓋上蓋子倒放，培養48h，計數每個(gè)平皿上的菌落數。

    日常監控時(shí)，可以設定可接受的菌落數限值。一般無(wú)菌室所有的取樣平皿上的細菌總數應小于15個(gè)�？諝赓|(zhì)量良好的無(wú)菌室，通常么個(gè)平皿上生長(cháng)的細菌不超過(guò)2個(gè)。

2.空氣過(guò)濾法：

    空氣采樣除了自然沉降法外，還可以使用專(zhuān)門(mén)的主動(dòng)式采樣器。主動(dòng)式采樣器可以評估風(fēng)險區空氣微生物的特征。主動(dòng)式采樣器主要包括過(guò)濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。

    撞擊采樣器可以分為狹縫式采樣器、離心式采樣器和針孔式采樣器。狹縫式采樣器由附加的真空抽氣泵抽氣，通過(guò)采樣器的縫隙式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉的平板培養基表面上，附著(zhù)的活微生物粒子經(jīng)過(guò)培養后形成菌落，予以計數。離心式采樣器由于內部風(fēng)機的高速旋轉，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心機的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時(shí)間撞擊到專(zhuān)用的固形培養條上，經(jīng)培養后形成菌落，予以計數。

    過(guò)濾式空氣采樣器是最常用、最簡(jiǎn)單的空氣采樣器。過(guò)濾式采樣器有采樣頭、濾器、流量計和抽氣泵組成。過(guò)濾式采樣器的結構如圖：

    開(kāi)動(dòng)電機后，抽氣泵工作，帶動(dòng)空氣吸入采樣頭，空氣通過(guò)濾器的時(shí)候，大于濾膜孔徑的顆粒被阻留，當達到預先設定吸氣體積后抽氣泵停止工作，將濾膜取出轉貼到培養基上，培養后計算空氣中微生物的濃度。過(guò)濾式采樣器捕獲效率高，但是濾膜材料可能影響微生物的存活率，還有采樣阻力大、流量易變的缺陷。

    在沒(méi)有空氣采樣器的情況下，可以自己組裝如下圖的空氣錯率采樣裝置，注意組裝連接處必須密不透風(fēng)。

    打開(kāi)圖中大瓶的龍頭，空氣就被抽入無(wú)菌水中。待4L水流完，就有4L空氣通過(guò)小瓶中的無(wú)菌水，也就是4L空氣中的微生物被留存在50mL無(wú)菌水中。無(wú)菌吸取1mL過(guò)濾的水樣進(jìn)行平板計數，做2個(gè)平行。37℃培養48h計數。

    每升空氣中的細菌數為：2個(gè)平皿上細菌數量的平均值×50/4。

三、無(wú)菌室物體表面微生物污染檢查

    表面微生物污染的檢查需要使用接觸器或拭子，獲得某表面某時(shí)間點(diǎn)的微生物數量。

    接觸器以容器內已知面積的固態(tài)培養介質(zhì)與表面接觸，接觸面積應大于20cm2，均勻用力將整個(gè)營(yíng)養介質(zhì)壓住表面幾秒鐘，不得移動(dòng)。然后將裝置放回容器內，再清潔采樣表面，清除殘留營(yíng)養物。接觸器培養后顯現的菌落可以給出原表面微生物的存活狀況的鏡像“圖”。

    使用拭子更為簡(jiǎn)單和靈活，用拭子擦拭某個(gè)表面，它抹去的微生物數量就可以計算出了。對接觸裝置觸及不到的、不平或有凹陷的非吸收性大表面，用拭子采樣特別方便。棉拭子的操作方法如下：

準備材料：自制無(wú)菌棉拭子或購買(mǎi)商品化的無(wú)菌棉拭子、內徑10cm×10cm無(wú)菌規格板、無(wú)菌生理鹽水、培養基平皿。

    如果取樣物體是平面的，將無(wú)菌規格板放在物體表面，用浸濕的無(wú)菌棉拭子在無(wú)菌規格板空心處橫豎涂抹均勻，涂抹時(shí)隨之轉動(dòng)棉拭子，剪去棉拭子與手接觸部分，將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌生理鹽水中待檢。

    將采樣管敲打80次以上是棉拭子上的細菌充分擴散，做適當稀釋?zhuān)�進(jìn)行平板計數，37℃培養48h計數。

細菌總數（CFU/cm2）=（平皿上菌落平均數×稀釋倍數）/采樣面積（cm2）

四、人員接觸面無(wú)菌檢查

    被檢人員洗手消毒后，五指并攏。將浸泡過(guò)的棉拭子沿雙手指屈從指根到指端往返涂擦兩次，涂擦的同時(shí)轉動(dòng)棉拭子。剪去操作者手接觸部位，將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌室生理鹽水中待檢。

    按“無(wú)菌室物體表面細菌污染檢查”的方法進(jìn)行樣品處理、接種、培養、計數和報告結果。

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