抗生素檢定用芽孢懸液的制備及注意事項

   管碟法是國內外常用的抗生素微生物檢定法，利用管碟法測定抗生素效價(jià)，具有準確、直觀(guān)、重復性好等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛采用。但是整個(gè)試驗過(guò)程中影響結果的因素很多，任何一個(gè)環(huán)節操作不當或者忽略就會(huì )造成很大誤差，導致整組試驗失敗。其中，芽孢懸液的制備就有很多需要注意的地方。

   在用管碟法檢定抗生素時(shí)，需要將菌懸液與培養基混合均勻、覆蓋在底層培養基上，以形成抑菌圈。其中，對于菌懸液的制備要求為：

   將所用菌的斜面培養物用1~2ml滅菌水洗下，形成菌懸液；將菌懸液在營(yíng)養瓊脂平皿上均勻涂布，置于35-37℃條件下培養7天；涂片、染色，鏡檢芽孢率≥85%時(shí)，用10ml滅菌水將芽孢和菌體的混合物洗下，制成懸液；65℃水浴加熱30min，殺死菌體，形成有活性的芽孢懸液；冷卻、冰箱中保存備用。

   根據實(shí)際操作中的經(jīng)驗，對這一環(huán)節需要注意的事項總結如下：

   1 應該嚴格按照標準操作，將涂好的平皿連續培養7天再洗脫芽孢，這樣也有助于芽孢懸液的均一性，避免由于操作標準不一造成的試驗結果的偏差。有文章報道，將平板培養至2、3、4、5、6天與培養至第七天，制成的懸液在抗生素效價(jià)測定中無(wú)差異；但本人在實(shí)際試驗中發(fā)現，培養3天的短小芽孢菌，鏡檢時(shí)芽孢率<80%,并且平皿一旦從培養箱中拿出來(lái)，室溫放置至第10天，芽孢率也不會(huì )再發(fā)生明顯變化，這顯然不符合《中國獸藥典》規定的芽孢率≥85%的要求。

   2試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時(shí)應保持菌種及菌液的新鮮。一般菌種一月轉種一次，冰箱冷藏保存。對易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進(jìn)行單菌分離；其他菌株可半年分離一次。
   3 試驗菌傳代最好不超過(guò)5次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養物用滅菌水洗下后，應在65℃加熱30分鐘，使菌體的菌齡一致（有資料顯示可70-75℃水浴30min殺死菌體）。
   4 加入菌懸液的體積，一般不少于0.3ml，并且不大于上層培養基體積的1%（有資料說(shuō)不大于2%）。如果加入菌懸液的體積過(guò)小，則在同次實(shí)驗中，不同次加入菌懸液的體積相差較大， 造成實(shí)驗誤差；如果加入菌懸液的體積過(guò)大，則會(huì )使上層培養基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養基中可能造成培養基結塊，影響測定結果。對于加入菌懸液體積的控制，可通過(guò)調節菌懸液的濃度來(lái)實(shí)現。

  下面為在海博生物技術(shù)公司生產(chǎn)的抗生素檢定Ⅳ號瓊脂上，莫能菌素對短小芽孢菌的抑菌效果：

圖a  連續培養7天的短小芽孢菌

圖b  莫能菌素對短小芽孢菌的抑菌效果

   從照片可以看出，菌懸液中芽孢率符合要求（≥85%），抑菌圈透明、邊緣清晰且直徑均勻，符合標準規定的18-22mm，效果非常好！

   注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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