出口食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌計數方法

1　范圍 

本標準規定了出口食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的計數檢驗方法。 

本標準適用于出口食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢驗。 

2　規范性引用文件 

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T 6682  分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法

SN/T 1538.1  培養基制備指南　第1部分：實(shí)驗室培養基制備質(zhì)量保證通則

SN/T 1538.2  培養基制備指南　第2部分：培養基性能測試實(shí)用指南3　術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件 

3  術(shù)語(yǔ)及定義 

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。 

3.1 

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌 

在特定的選擇性培養基上，細菌菌落生長(cháng)呈現黑色特點(diǎn)（亞硫酸鹽降解為硫化物而形成黑色沉淀物，并使菌落呈現黑色），分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，48ｈ內能液化明膠的細菌。 

4　設備和材料 

4.1　無(wú)菌吸管：1.0ｍＬ 和10.0ｍＬ，分刻度分別為0.1ｍＬ 和1.0ｍＬ。 

4.2　無(wú)菌培養皿：直徑90ｍｍ。 

4.3　均質(zhì)器及均質(zhì)袋（或均質(zhì)杯）。 

4.4　恒溫培養箱或厭氧培養箱：37℃±0.5 ℃。 

4.5　恒溫水浴鍋：46 ℃±0.5 ℃。 

4.6　厭氧發(fā)生裝置。 

4.7　放大鏡和（或）菌落計數器。 

4.8　光學(xué)顯微鏡10×～100×。 

4.9　冰箱：2 ℃～8 ℃。 

4.10　天平：感量0.1ｇ。 

4.11　全自動(dòng)微生物鑒定系統。 

５　培養基和試劑 

除另有規定外，所用試劑均為分析純，水為GB／T 6682規定的分析實(shí)驗室用水。 

5.1　亞硫酸鹽�箔h(huán)絲氨酸瓊脂（SC）：見(jiàn)Ａ．１。 

5.2　液體硫乙醇酸鹽培養基：見(jiàn)Ａ．２。 

5.3　乳糖亞硫酸鹽培養基（LS）：見(jiàn)Ａ．３。 

5.4　緩沖動(dòng)力�蚕跛猁}培養基：見(jiàn)Ａ．４。 

5.5　亞硝酸鹽檢測試劑：見(jiàn)Ａ．５。 

5.6　鋅粉。 

5.7　乳糖�裁髂z培養基：見(jiàn)Ａ．６。 

5.8　蛋白胨水：見(jiàn)Ａ．７。 

5.9�。郑桑裕牛耍玻粒危缮�化鑒定卡。 

6　檢驗程序 

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢驗程序見(jiàn)圖 

7　操作步驟 

7.1　樣品的稀釋 

7.1.1　無(wú)菌操作稱(chēng)取檢樣25ｇ（ｍＬ）放入無(wú)菌均質(zhì)器或均質(zhì)袋中，加入225 ｍＬ 蛋白胨水，均質(zhì)，制成1∶10樣品勻液。 

7.1.2　吸取1∶10樣品勻液1ｍＬ，加入到9ｍＬ 蛋白胨水中，混合均勻，制成1:100樣品勻液。必要時(shí)，按此法將樣品作進(jìn)一步的10倍遞增稀釋。 

7.2　接種與培養 

7.2.1　選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），每個(gè)稀釋度分別吸取1ｍＬ 樣品勻液加入到兩個(gè)無(wú)菌平皿內。 

7.2.2　將10ｍＬ～15ｍＬ 維持在44 ℃～47 ℃的SC瓊脂傾注平皿，轉動(dòng)平皿使其混合均勻。待培養基凝固后，再覆蓋上10ｍＬSC瓊脂，待其完全凝固。 

7.2.3　翻轉平板，放入厭氧罐或其他適宜容器中，厭氧環(huán)境下37℃±0.5 ℃下培養20ｈ±2ｈ。培養時(shí)間過(guò)長(cháng)可能會(huì )導致平板顏色過(guò)黑。 

7.3　平板計數 

7.3.1　選取菌落數＜150ＣＦＵ 的平板，計數每個(gè)平板上的黑色菌落數，記錄稀釋倍數。 

7.3.2　每個(gè)平板挑�。祩�(gè)典型或可疑菌落（小于５個(gè)時(shí)應全部挑選）進(jìn)行確證。 

7.4　乳糖�瞾喠蛩猁}試驗確證 

7.4.1　接種 

將SC 瓊脂上的典型或可疑菌落接種到液體硫乙醇酸鹽培養基中，厭氧環(huán)境下37℃±0.5 ℃下培養18ｈ～24ｈ。以無(wú)菌吸管移取硫乙醇酸鹽培養物5滴加入到乳糖�瞾喠蛩猁}（LS）培養基中。46 ℃水浴中需氧條件下培養18ｈ～24ｈ。 

7.4.2　觀(guān)察 

觀(guān)察倒管內有否氣泡產(chǎn)生及試管底部是否變黑（亞硫酸鐵沉淀），若倒管中四分之一以上充滿(mǎn)氣體并且有黑色沉淀物則可判定為陽(yáng)性。當倒管中產(chǎn)生的氣體不足四分之一時(shí)，立即以無(wú)菌吸管從先前的ＬＳ培養基中吸取5滴加到另一LS培養基試管中，46℃水浴培養18ｈ～24ｈ，再次觀(guān)察結果。 

7.4.3　判讀 

在SC 培養基中形成黑色菌落，同時(shí)LS培養基中反應陽(yáng)性的細菌，可確認為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，除此之外應視為陰性。 

7.5　動(dòng)力�蚕跛猁}試驗和乳糖�裁髂z液化試驗確證 

7.5.1　純化 

7.5.2　接種 

將挑取的純菌落分別穿刺接種緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養基和乳糖明膠培養基，厭氧條件下37℃ ±0.5 ℃培養24ｈ。 

7.5.3　動(dòng)力�蚕跛猁}試驗觀(guān)察 

在透射光下檢查緩沖動(dòng)力�蚕跛猁}培養基試管中細菌沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)情況，有動(dòng)力的菌株沿著(zhù)穿刺線(xiàn)呈擴散生長(cháng)；沒(méi)有動(dòng)力的菌株，僅沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)。分別加0.5ｍＬ 試劑甲與0.2ｍＬ 試劑乙于緩沖動(dòng)力硝酸鹽培養基中以檢查亞硝酸鹽的存在。出現橙紅色者，表明有菌株將硝酸鹽還原成了亞硝酸鹽。若15ｍｉｎ內未出現顏色變化，則添加少許金屬鋅粉，放置10ｍｉｎ。如果加鋅粉后出現橙紅色，表明菌株不能還原硝酸鹽。若出現微弱的亞硝酸鹽反應（如：淺粉色）則應排除，因為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的反應比較劇烈而且迅猛。 

7.5.4　乳糖�裁髂z試驗觀(guān)察 

發(fā)現產(chǎn)氣和培養基變黃色，表明乳糖發(fā)酵并產(chǎn)酸。將試管置5℃冷卻1ｈ，檢查明膠液化情況。若培養基仍為固態(tài)，則需37 ℃±0.5 ℃再培養24ｈ，再次檢查明膠是否液化。 

7.5.5　判讀 

在SC 瓊脂上形成黑色菌落，無(wú)動(dòng)力的，通常會(huì )將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，48ｈ內能液化明膠的細菌，確認為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌。 

7.6　自動(dòng)微生物鑒定系統確證 

將SC 瓊脂上的典型或可疑菌落接種到液體硫乙醇酸鹽培養基中，厭氧條件下37℃±0.5 ℃培養18ｈ～24ｈ，劃線(xiàn)接種SC瓊脂平板，再覆蓋上10ｍLSC瓊脂。待其完全凝固后，厭氧條件下37℃±0.5℃培養18ｈ～24ｈ，獲得純培養菌落。如有必要，可重復上述步驟，以獲得完全分離的，典型的黑色菌落。 

如選擇VITEK compact，可從SC平板上挑選可疑菌落，用生理鹽水制成濁度適當的菌懸液，使用VITEK compact全自動(dòng)微生物鑒定系統進(jìn)行鑒定。 

7.7　判定 

任何符合7.4.3或者7.5.5的判讀確證或者經(jīng)7.6的鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落，確認為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌。 

8　結果報告 

樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的計數，基于被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌落的百分數。 

例如：10^-4稀釋的平板中，平均有85個(gè)菌落，由2個(gè)平板上選取的10個(gè)菌落中，有8個(gè)被證實(shí)為產(chǎn)氣莢膜梭菌，那么每克食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數，即為85×（8／10）×10000＝680000CFU。 

根據計算結果報告檢樣中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數／g（ml）。 

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