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1 范圍
本標準規定了食品中弓形菌的檢驗方法。
本標準適用于食品中布氏弓形菌、嗜低溫弓形菌和斯氏弓形菌的檢驗。
2 規范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的應用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 6682 分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法
GB 19489 實(shí)驗室 生物安全通用標準
GB/T 27403 實(shí)驗室質(zhì)量控制規范 食品分子生物學(xué)檢測
GB/T 27405 實(shí)驗室質(zhì)量控制規范 食品微生物檢測
3 術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
3.1
弓形菌
弓形菌，為變形菌門(mén)Σ-變形菌綱彎曲菌目彎曲菌科的一個(gè)新屬。呈彎曲或螺旋形桿狀，不產(chǎn)芽孢，最佳生長(cháng)氧氣濃度為微量氧氣（3%-10%），正常大氣氧濃度條件下也可生長(cháng)的革蘭氏陰性細菌。
4 生物安全措施
為了保護實(shí)驗室人員的安全，應由具備資格的工作人員檢測弓形菌，所有培養物和廢棄物應參照GB 19489、GB/T 27403和GB/T27405中的有關(guān)規定執行。
5 設備和材料
除微生物實(shí)驗室常規滅菌與培養設備外，其他設備與材料如下：
5.1 冰箱：2℃-8℃。
5.2 恒溫培養箱：25℃±1℃，30℃±1℃，36℃±1℃。
5.3 水浴或其他恒溫裝置：30℃±1℃，98℃。
5.4 微需氧培養裝置：提供微需氧條件（5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣）。
5.5 電子天平：感量0.1g。
5.6 均質(zhì)器。
5.7 過(guò)濾裝置及濾膜（0.22μm，0.45μm）。
5.8 顯微鏡：10×~100×,有相差功能。
5.9 離心機:離心機大于等于20000g。
5.10 核酸蛋白分析儀。
5.11 基因擴增儀。
5.12 電泳儀。
5.13 凝膠成像分析系統。
6 培養基和試劑
除有特殊說(shuō)明外，所有試驗用試劑均為分析純，實(shí)驗用水應符合GB/T 6682中一級水的要求。
6.1 JM肉湯
6.2 JM瓊脂
6.3 弓形菌瓊脂
6.4 布氏肉湯
6.5 布氏瓊脂
6.6 氧化酶試劑
6.7 三糖鐵瓊脂
6.8 Hugh-Leifson培養基
6.9 馬尿酸鈉水解試劑
6.10 吲哚乙酸紙片
6.11 Mueller Hinton血瓊脂
6.12 1mol/L,Tris-HCL緩沖液（pH8.0):稱(chēng)取121.1gTris,溶于800ml水中，攪拌，加入濃鹽酸42ml，冷卻至室溫，用稀鹽酸準確調整pH至8.0，分裝后高壓滅菌備用。
6.13 0.5mol/L EDTA(pH8.0)：在800ml水中加入186.1gNa-EDTA*2H2O,在磁力攪拌器劇烈攪拌，用氫氧化鈉調節濃度pH值至8.0（約20g氫氧化鈉顆粒），然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。
6.14 DNA提取液：量取100ml1mol/L Tris-HCL,50ml0.5mol/LEDTA,稱(chēng)取5.0gSDS,16.848g氯化鈉，定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。
6.15 引物：見(jiàn)表1.
6.16 Taq乘合酶。
6.17 dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。
6.18 10×PCR緩沖液:100 mmol/L氯化鉀，160 mmol/L硫酸鐵，20 mmol/L硫酸鎂.200 mmol/LTris-Hα(pH8.8)，1 % TritonX-100, 1 mg/mL BSA。
6.19 DNA Marker。
6.20 質(zhì)控參考菌株:布氏弓形菌ATCC 49616、嗜低溫弓形茵ATCC 43158和斯氏弓形菌ATCC51332(或共他可溯源的菌株)。
6.21 10×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍，40%蔗糖。
6.22 瓊脂糖:電泳級。
6.23 溴化乙錠:10 mg/mL。
6.24 50×TAE電泳儲備液：稱(chēng)取484 g Tris，量取114.2mL乙酸，200 mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0),溶于蒸餾水中,定容至2 L。分裝后高壓滅菌備用。
第一法 常規檢測方法
7 檢驗程序
見(jiàn)圖1。
8.1 樣品處理
8.1.1 一般樣品
取25 g(或25 mL)樣品加入盛有225 mL JM肉湯的有濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中(無(wú)濾網(wǎng)的均質(zhì)袋可使用無(wú)菌紗布過(guò)濾)，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min-2 min；或加入盛有225 mL JM肉湯的均質(zhì)杯中.以8 000r/min-10 000 r/min均質(zhì)1min-2 min,經(jīng)濾網(wǎng)或克菌紗布過(guò)。.將濾液進(jìn)行培養。
8.1.2整禽等樣品
用200 mL0.1%的蛋白胨水充分沖洗樣品的內外部,并振蕩2min-3min,經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾至250 mL離心管中,16 000 g離心15 min后棄去上清,用10 mL0.1%蛋白胨水懸浮沉淀,吸取3mL于100 mL JM肉湯中。
8.1.3 需表面涂拭檢測的樣品
無(wú)菌棉簽涂布樣品表面(面積為50 cm2-100 cm2).將棉簽頭剪落到100 mL JM肉湯中進(jìn)行培養。
8.1.4 水樣
將4L的水（對于氯處理的水過(guò)濾前每升水中加人5 mL 1mol/L硫代硫酸鈉溶液)經(jīng)0.45μm.濾膜過(guò)濾,將濾膜浸沒(méi)在100 mL JM肉湯中進(jìn)行培養。
8.2 增菌
30℃土1℃培養44 h士4 h。必要時(shí)測定增菌液的pH值并調整至7.2士0.2。
8.3 分離
增菌液劃線(xiàn)接種于JM瓊脂與弓形茵掠脂平板上,30℃士1℃培養24 h-48 ho觀(guān)察24 h培養與48 h培養的瓊脂平板上的菌落形態(tài)。弓形菌在JM瓊脂平板上形成灰色至白色、有或無(wú)紅色暈輪、圓形、宜徑約為1 mm-2 mm的菌落；弓形菌在弓形菌瓊脂上形成半透明、淺黃色、光滑、圓形、宜徑約為1 mm-2 mm的菌落。
8.4 弓形苗的形態(tài)和生化磐定
8.4.1 純培養
挑取5個(gè)或更多的可疑菌落接種到布氏瓊脂平板上,30℃±1℃培養24 h-48 h,按照8.4.1-8.4. 9進(jìn)行鑒定,結果符合表2的可疑茵藩確認為弓形菌.必要時(shí),還可參照附錄B進(jìn)行弓形菌屬內種的鑒別。
8.4.2 形態(tài)觀(guān)囊
挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢。
8.4.3 動(dòng)力觀(guān)察
挑取可疑茵落用1 mL布氏肉湯懸浮,用相羞顯微鏡觀(guān)察運動(dòng)狀態(tài).
8.4.4 氧化酶試驗
用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上,如果在10 s內出現紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽(yáng)性。
8.4.5 微需氧條件下25℃生長(cháng)斌驗
挑取可疑菌落,接種到哥倫比亞血瓊脂平板上,微需氧條件下25℃土1℃培養44 h土4 h,觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。
8.4.6 三糖鐵(TSI)生長(cháng)試驗
挑取可疑菌落,穿刺并劃線(xiàn)接種到TSI高層斜面.30℃土1℃墻養24 h-48 h，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。弓形菌不產(chǎn)H2S，多數弓形菌產(chǎn)堿，底層和斜面均為紅色。
8.4.7 Hugh-Leifson培養基穿刺生長(cháng)
挑取可疑菌落,穿刺接種Hugh-Leifson培養基,30℃士1℃培養44h土4 h,弓形菌可在穿刺線(xiàn)周?chē)霈F混濁生長(cháng).不發(fā)酵葡萄塘,培養基仍為藍色。
8.4.8 馬尿酸鈉水解試驗
挑取菌落，加到盛有0.4 mL 1%馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液�；旌暇鶆蚝笤�36℃±1℃水浴放置2 h或36℃土1℃培養箱中放置4 h。沿著(zhù)試臂壁緩緩加人0.2 mL茚三酮溶液,不要振蕩,在36℃士1℃的水浴或培養箱中放宜10 min后判讀結果。若出現深紫色則為陽(yáng)性；出現淡紫色或沒(méi)有顏色變化則為陰性。
8.4.9 吲哚乙酸酯水解試驗
挑取菌落至吲哚乙酸酯紙片上,再滴加一滴滅菌水。如果吲哚乙酸酯水解，則在5 min-10min內出現深藍色;若無(wú)顏色變化則沒(méi)有發(fā)生水解。
8.4.10 藥物敏感性試驗(可選擇)
挑取菌落,在布氏肉湯中制各成濃度為0.5 McFarland的菌懸液,在Mueller Hinton血瓊脂平板上進(jìn)行涂布.涂布時(shí)應從不同角度涂布.至少涂3次,靜置5 min后去除多余液體,將平板在培養箱申放置10 min進(jìn)行干燥。將頭孢金素(30微克)藥敏紙片放在瓊脂表面。將平板里于微需氧條件下30℃士1℃培養44 h土4 h。如果細菌緊貼紙片生長(cháng)則為有抗性，生長(cháng)試驗陽(yáng)性；如果紙片周?chē)霈F不同程度的細菌抑制生長(cháng)則為敏感.生長(cháng)試驗陰性。多致弓形茵30雌頭袍金素生長(cháng)試驗陽(yáng)性.但少數斯氏弓形菌生長(cháng)試驗陰性。
9 結果報告
綜合上述檢驗結果.報告檢樣單位中檢出或未檢出弓形菌。
第二法 PCR法
10 檢測步驟
10.1 樣品處理、增菌和分離
樣品處理、增菌和分離按第一法進(jìn)行。
10.2 PCR模板的制備
取1 mL增菌肉湯至8000 r/min離心5 min，棄上清液,加人50μL DNA提取液.振蕩混勻,98℃熱處理5 min一10 min，12 000r/min離心5 min取上清液作為模板.可疑菌落則加入50μLDNA提取液,振蕩混勻,98℃熱處理5min-10min，12 000 r/min離心5 min取上猜液作為模版也可使用等效的商品化的DNA提取試劑盒并按其說(shuō)明提取制備DNA模版。
10.3 所搜取DNA的質(zhì)量評估
樣品提取的DNA用核酸蛋自分析儀翻定，OD260與OD280的吸光比值介于1.7-2.0較好,符合PCR檢測要求。
10.4 PCR檢測
10.4.1 PCR反應體系
反應體系總體積50μL:5μL 10 X PCR緩沖液:1.5 mmol MgC12:引物各50 pmol;1.5 U Taq聚合酮;4種dNTP終濃度各0.2m mol/L;2μL模板。
10.4.2 PCR反應條件
pcR擴增的目的基因、擴堵片段長(cháng)度、引物和PCR反應條件見(jiàn)表3。附錄C還給出了各檢測基因序列。
10.4.3 PCR質(zhì)控對照
每次進(jìn)行PCR檢測均需要設置陽(yáng)性對照、陰性對照和空白對照。其中,用布氏弓形菌、嗜低溫弓形菌和斯氏弓形茵檢測序列的DNA(或質(zhì)粒)作為陽(yáng)性對照.用非弓形茵的其他標誰(shuí)茵株的DNA作陰性對照。用雙蒸水替代模板作空白對照.
10.4.4 PCR擴增產(chǎn)物電泳
用電泳緩沖液(1×TAE)制各1.8%一2%瓊脂糖凝膠(55℃一60℃時(shí)加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/mL,也可在電泳后進(jìn)行染色)。取8μL-15μL PCR擴增產(chǎn)物,分別和2μL上樣緩沖液混合，進(jìn)行點(diǎn)樣,用DNA分子量標記物做參照。3 V/cm-5 V/cn恒壓電泳,電泳20 min-60 min,電泳檢測結果用凝膠成像分析系統記錄并保存。
10.4.5 PCR擴增結果判斷
10.4.5.1 在陽(yáng)性對照擴增出預期大小的條帶、陰性對照和空白對照未擴增出目的條帶的條件下,如樣品PCR擴增出1202 bp條帶,且同時(shí)擴增出2061 bp.198 bp或395 bp中的任何條帶者(可為其中1-3條) ,即判斷樣品PCR產(chǎn)物為弓形菌陽(yáng)性.其他情況判斷樣品PCR產(chǎn)物為弓形菌陰性。
10.4.5.2 如陽(yáng)性對照末擴增出預期大小的條帶,或陰性對照、空白對照擴增出目的條帶時(shí),本次檢測結果無(wú)效,應重新做實(shí)驗,以排除污染因素。
10.4.6 確認試驗
對于PCR擴增為弓形菌陽(yáng)性的樣晶.用第一法進(jìn)行確認。對于可疑純菌落,也可用PCR法進(jìn)行確認,必要時(shí),還可對PCR擴增產(chǎn)物測序進(jìn)一步確認。
11 結果報告
11.1 當增菌液PCR產(chǎn)物電泳檢驗結果為弓形菌陰性時(shí).報告檢驗單位中未檢出弓形茵。
11.2 當增菌液或可疑純菌落的PCR產(chǎn)物電泳檢驗結果為弓形菌陽(yáng)性時(shí),根據確認試驗結果,報告檢驗單位中檢出或未檢出弓形菌。
