GBT 4789.41-2016 腸桿菌科檢驗

１　范圍
本標準規定了食品中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的檢驗方法。
本標準第一法適用于腸桿菌科含量較高的食品中腸桿菌科的計數；第二法適用于腸桿菌科含量較低食品中腸桿菌科的計數。
２ 術(shù)語(yǔ)和定義
２.１
腸桿菌科　
在給定條件下發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、氧化酶陰性的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。
２.２
腸桿菌科計數　
按本標準規定方法，對每克或每毫升檢樣中的腸桿菌科進(jìn)行計數。
２.３
最可能數　
基于泊松分布的一種間接計數方法。
３ 設備和材料
除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
３．１　恒溫培養箱：３６ ℃±１ ℃。
３．２　冰箱：２ ℃～５ ℃。
３．３　水浴箱：４６ ℃±１ ℃。
３．４　天平：感量０．１ｇ。
３．５　顯微鏡：１０倍～１００倍。
３．６　均質(zhì)器。
３．７　振蕩器。
３．８　無(wú)菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ 刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ 刻度）或微量移液器及吸頭。
３．９　無(wú)菌錐形瓶或等效容器：容量１５０ｍＬ、５００ｍＬ。
３．１０　無(wú)菌培養皿：直徑９０ｍｍ。
３．１１　無(wú)菌試管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ、１５ｍｍ×１５０ｍｍ。
３．１２�。穑� 計或ｐＨ 比色管或精密ｐＨ 試紙。
４　培養基和試劑
４．１　緩沖蛋白胨水（ＢＰＷ）：見(jiàn)Ｂ．１。
４．２　緩沖葡萄糖煌綠膽鹽肉湯（ＥＥ 肉湯）：見(jiàn)Ｂ．２。
４．３　結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（ＶＲＢＧＡ）：見(jiàn)Ｂ．３。
４．４　營(yíng)養瓊脂（ＮＡ）：見(jiàn)Ｂ．４。
４．５　葡萄糖瓊脂：見(jiàn)Ｂ．５。
４．６　革蘭氏染色液：見(jiàn)Ｂ．６。
４．７　氧化酶試劑：見(jiàn)Ｂ．７。
４．８　無(wú)菌１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ：見(jiàn)Ｂ．８。
４．９　無(wú)菌１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ：見(jiàn)Ｂ．９。
第一法　腸桿菌科平板計數法
５　檢驗程序
腸桿菌科平板計數法檢驗程序見(jiàn)圖１。

６　操作步驟
６．１　樣品的稀釋
６．１．１　固體和半固體樣品：稱(chēng)�。玻担� 樣品放入盛有２２５ ｍＬＢＰＷ 的無(wú)菌均質(zhì)杯中，８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均質(zhì)１ ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或放入盛有２２５ ｍＬ ＢＰＷ 的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０的樣品勻液。
６．１．２　液體樣品：以無(wú)菌吸管吸�。玻担恚� 樣品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ 的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jì)阮A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成１∶１０的樣品勻液。
６．１．３　用１ｍＬ 無(wú)菌吸管或微量移液器吸�。薄茫保皹悠穭蛞海保恚�，沿管壁緩緩注入盛有９ｍＬＢＰＷ 的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不應觸及稀釋液面），振搖試管或換用１支１ ｍＬ 無(wú)菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成１∶１００的樣品勻液。
６．１．４　按６．１．３操作程序，依次制成１０倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋?zhuān)贝�，換用１支１ｍＬ 無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)１５ｍｉｎ。
６．２　傾注平板和培養
６．２．１　根據對樣品污染狀況的估計及相關(guān)限量要求，選擇２個(gè)～３個(gè)適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種２個(gè)無(wú)菌平皿。同時(shí)，分別吸�。保恚蹋拢校� 加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內作為空白對照。
６．２．２　將１０ｍＬ～１５ｍＬ 冷卻至４６ ℃的ＶＲＢＧＡ（可放置于４６ ℃±１ ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉平皿，使樣品勻液與培養基充分混勻。
６．２．３　待瓊脂凝固后，傾注一薄層同樣的培養基覆蓋平板表層。防止蔓延生長(cháng)并使菌落特征更為
明顯。
６．２．４　待ＶＲＢＧＡ 平板上層瓊脂凝固后翻轉平板，３６ ℃±１ ℃培養１８ｈ～２４ｈ。
６．３　典型菌落計數和確認
６．３．１　腸桿菌科典型菌落為有或無(wú)沉淀環(huán)的粉紅色至紅色或紫色菌落。選取典型菌落數在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ 之間、無(wú)蔓延菌落生長(cháng)的平板，只計數典型菌落數。菌落計數以菌落形成單位（ＣＦＵ）表示。
６．３．２　其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí)，則不宜采用，而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋
度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個(gè)平板后乘以２，代表一個(gè)平板菌落數。
６．３．３　當平板上出現菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(cháng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計數。
６．３．４　從每個(gè)平板上至少挑�。祩�(gè)（小于５個(gè)全選）典型菌落進(jìn)行確認；如果有不同形態(tài)的典型菌落，則每種形態(tài)分別至少挑�。眰�(gè)菌落進(jìn)行確認。
６．３．５　典型菌落的確認：
ａ）　分別將所挑選的每一個(gè)菌落，劃線(xiàn)于營(yíng)養瓊脂平板，３６ ℃±１ ℃培養１８ｈ～２４ｈ，挑取平板上的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗及葡萄糖發(fā)酵試驗。
ｂ）　革蘭氏染色鏡檢：腸桿菌科為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽孢，大小為（０．３～１．０）μｍ× （１．０～６．０）μｍ。
ｃ）　氧化酶試驗：用鉑／銥接種環(huán)或玻璃棒（不要用鎳鉻接種環(huán)）挑取單個(gè)菌落涂于浸濕氧化酶試劑的濾紙上，濾紙的顏色在１０ｓ內變成藍紫色，判為陽(yáng)性反應。
ｄ）　葡萄糖發(fā)酵試驗：用接種針挑取少許氧化酶陰性的同一個(gè)菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂內，于３６ ℃±
１ ℃培養２４ｈ±２ｈ，若試管內的內容物變?yōu)辄S色，判為陽(yáng)性反應。
６．４　結果的計算
６．４．１　一般原則
若有兩個(gè)連續稀釋度的平板典型菌落數在適宜計數范圍內，按式（１）計算，示例見(jiàn)Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４。

　式中：
N———樣品中腸桿菌科菌落數；
Σa———確證的腸桿菌科菌落數之和；
n1 ———第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個(gè)數（含確證的腸桿菌科菌落）；
n2 ———第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個(gè)數（含確證的腸桿菌科菌落）；
d———稀釋因子（第一稀釋度）。
其中，a按式（２）計算：

　式中：
a———確證的腸桿菌科菌落數；
b———某一平板中犃個(gè)菌落中被確證為腸桿菌科的菌落數，b≤A；
A———某一平板中用于確認試驗的菌落數；
C———某一平板中典型菌落總數。
６．４．２　低菌落數
若最低稀釋度（包括液體樣品原液）平板的典型菌落數均小于１５ＣＦＵ，具有確證的腸桿菌科菌落，
則以確證的菌落數乘以最低稀釋倍數計算。
若最低稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(cháng)，或典型菌落數均小于１５ＣＦＵ，且無(wú)確證的
腸桿菌科菌落，則以小于１乘以最低稀釋倍數計算。
６．４．３　特殊情況
第一稀釋度平板上的典型菌落數均大于１５０ＣＦＵ，且有確證的腸桿菌科菌落，以及第二稀釋度平板上無(wú)確證的腸桿菌科菌落或典型菌落數不在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ 之間，則以確證的菌落數乘以第一稀釋倍數計算，示例見(jiàn)Ａ．５。
若所有稀釋度的平板上典型菌落數均不在適宜計數范圍內，且無(wú)確證的腸桿菌科菌落，則以小于１乘以最低稀釋倍數計算。
７　報告
７．１　菌落數小于１００時(shí)，以整數報告。
７．２　菌落數大于或等于１００時(shí)，對第３位數字進(jìn)行修約后，取前２位數字，后面用０代替位數；也可用１０的指數形式來(lái)表示，采用兩位有效數字。
７．３　數字修約按“四舍五入”原則進(jìn)行。
７．４　若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計數，則報告菌落蔓延。
７．５　若空白對照上有菌落生長(cháng)，則此次檢測結果無(wú)效。
７．６　稱(chēng)重取樣以ＣＦＵ／ｇ為單位報告，體積取樣以ＣＦＵ／ｍＬ 為單位報告。
第二法　腸桿菌科犕犘犖計數法
８　檢驗程序
腸桿菌科ＭＰＮ 計數法檢驗程序見(jiàn)圖２。

９　操作步驟
９．１　樣品的稀釋
按６．１進(jìn)行。
９．２　接種和培養
９．２．１　非選擇性前增菌
根據對樣品污染狀況的估計及相關(guān)限量要求，選擇３ 個(gè)適宜連續稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度３管，共９管ＢＰＷ 于３６ ℃ ±１ ℃培養１８ｈ±２ｈ。
９．２．２　選擇性增菌
從ＢＰＷ 各培養管中，分別移�。保恚� 培養物，接種于１０ｍＬ 的ＥＥ 肉湯中，３６℃±１℃培養２４ｈ±２ｈ。
９．２．３　分離
用接種環(huán)從ＥＥ 各肉湯管中分別取培養物１環(huán)，劃線(xiàn)接種于ＶＲＢＧＡ 平板，３６ ℃±１ ℃培養２４ｈ±２ｈ，觀(guān)察平板上有無(wú)典型菌落。
９．３　典型菌落的確認
典型菌落確認見(jiàn)６．３。
１０　報告
腸桿菌科為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、氧化酶陰性。只要有１個(gè)菌落確認為腸桿菌科，其所代表的ＥＥ 管即為腸桿菌科陽(yáng)性，依據ＥＥ 陽(yáng)性管數查ＭＰＮ 表（見(jiàn)附錄Ｃ），報告每克（毫升）樣品中腸桿菌科的ＭＰＮ 值。稱(chēng)重取樣以ＭＰＮ／ｇ為單位報告，體積取樣以ＭＰＮ／ｍＬ 為單位報告。

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