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第二法 單核細胞增生李斯特氏菌平板計數法
6. 檢驗程序
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 以無(wú)菌操作稱(chēng)取樣品25g（mL），放入盛有225 mL 緩沖蛋白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋內（或均質(zhì)杯）內，連續均質(zhì)1 min～2 min或以8000 r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2 min。液體樣品，振蕩混勻，制成1:10的樣品勻液。
7.1.2 用 1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL緩沖蛋白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支 1 mL 無(wú)菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。
7.1.3 按 7.1.2 操作程序，制備 10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用 1 支 1 mL 無(wú)菌吸管或吸頭。
7.2 樣品的接種
根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板中，用無(wú)菌L 棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如瓊脂平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培養箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
7.3 培養
7.3.1 在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱36 ℃±1 ℃培養1 h；等樣品勻液吸收后翻轉平皿，倒置于培養箱，36 ℃±1 ℃培養24h～48h。
7.4 典型菌落計數和確認
7.4.1單核細胞增生李斯特氏菌在ALOA平板上為藍綠色菌落,周?chē)胁煌该鲿炄Γ?/span>在其他李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產(chǎn)品說(shuō)明為準。
7.4.2選擇有典型單核細胞增生李斯特氏菌菌落的平板，且同一稀釋度3 個(gè)平板所有菌落數合計在15 CFU～150 CFU之間的平板，計數典型菌落數。如果：
a）只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數在15CFU～150CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
b）所有稀釋度的平板菌落數均小于15 CFU且有典型菌落，應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；
c）某一稀釋度的平板菌落數大于150 CFU 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
d）所有稀釋度的平板菌落數大于150 CFU 且有典型菌落，應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；
e）所有稀釋度的平板菌落數均不在15 CFU～150 CFU 之間且有典型菌落，其中一部分小于15 CFU 或大于150CFU 時(shí)，應計數最接近15CFU 或150 CFU的稀釋度平板上的典型菌落。
以上按公式（1）計算。
f）2 個(gè)連續稀釋度的平板菌落數均在15CFU～150 CFU 之間，按公式（2）計算。
7.4.3 從典型菌落中任選5 個(gè)菌落（小于5 個(gè)全選），分別按5.3、5.4或5.5進(jìn)行鑒定和確認試驗。
8.結果計數
公式（1）：
式中：
T——樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落數；
A——某一稀釋度典型菌落的總數；
B——某一稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數；
C——某一稀釋度用于單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數；
d——稀釋因子。
公式（2）：
式中：
T ——樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落數；
A1——第一稀釋度（低稀釋倍數）典型菌落的總數；
A2——第二稀釋度（高稀釋倍數）典型菌落的總數；
B1——第一稀釋度（低稀釋倍數）確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數；
B2——第二稀釋度（高稀釋倍數）確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數；
C1——第一稀釋度（低稀釋倍數）用于單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數；
C2——第二稀釋度（高稀釋倍數）用于單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數；
1.1——計算系數；
d ——稀釋因子（第一稀釋度）。
9.結果報告
報告每g（mL）樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌數，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。
第三法 單核細胞增生李斯特氏菌MPN計數法
10 檢驗程序
11．操作步驟
11.1 樣品的稀釋
按7.1進(jìn)行。
11.2接種和培養
11.2.1根據對樣品污染狀況的估計，選取3個(gè)適宜連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），接種于10 mLLB1肉湯，每一稀釋度接種3管，每管接種1 mL（如果接種量需要超過(guò)1 mL，則用雙料LB1增菌液）于30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。每管各移取0.1 mL，轉種于10 mL LB2增菌液內，于30 ℃±1 ℃培養24±2 h。
11.2.2 用接種環(huán)從各管中移取1環(huán)，分別接種李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板，36 ℃±1 ℃培養24 h～48 h。
11.3 確證試驗
自每塊平板上挑取5個(gè)典型菌落（5個(gè)以下全選），按照5.3、5.4或5.5進(jìn)行鑒定。
12 結果與報告
根據證實(shí)為單核細胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性的試管管數，查MPN檢索表（見(jiàn)附錄B），報告每g（mL）樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的最可能數，以MPN/g（mL）表示。
附錄A
（規范性附錄）
培養基和試劑
A.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)
A.1.1 成分
胰胨 17.0 g
多價(jià)胨 3.0 g
酵母膏 6.0 g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鉀 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.1.2 制法
將上述各成分加熱攪拌溶解，調節pH，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。
A.2 含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
胰胨 17.0 g
多價(jià)胨 3.0 g
酵母膏 6.0 g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鉀 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.2.2 制法
將上述各成分加熱攪拌溶解，調節pH，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。
A.3 李氏增菌肉湯(LB1，LB2)
A.3.1 成分
胰胨 5.0 g
多價(jià)胨 5.0 g
酵母膏 5.0 g
氯化鈉 20.0 g
磷酸二氫鉀 1.4 g
磷酸氫二鈉 12.0 g
七葉苷 1.0 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.3.2 制法
將上述成分加熱溶解，調節pH，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。
A.3.2.1 李氏Ⅰ液 (LB1)225 mL中加入：
1 % 萘啶酮酸 (用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液配制) 0.5 mL
1 % 吖啶黃 (用無(wú)菌蒸餾水配制) 0.3 mL
A.3.2.2 李氏Ⅱ液 (LB2)200 mL中加入：
1 % 萘啶酮酸 0.4 mL
1 %吖啶黃 0.5 mL
A.4 PALCAM瓊脂
A.4.1 成分
酵母膏 8.0 g
葡萄糖 0.5 g
七葉甙 0.8 g
檸檬酸鐵銨 0.5 g
甘露醇 10.0 g
酚紅 0.1 g
氯化鋰 15.0 g
酪蛋白胰酶消化物 10.0 g
心胰酶消化物 3.0 g
玉米淀粉 1.0 g
肉胃酶消化物 5.0 g
氯化鈉 5.0 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.4.2 制法
將上述成分加熱溶解，調節pH，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。
A.4.2.1 PALCAM選擇性添加劑
多粘菌素B 5.0 mg
鹽酸吖啶黃 2.5 mg
頭孢他啶 10.0 mg
無(wú)菌蒸餾水 500 mL
A.4.2.2 制法
將PALCAM基礎培養基溶化后冷卻到50 ℃，加入2 ml PALCAM選擇性添加劑，混勻后傾倒在無(wú)菌的平皿中，備用。
A.5 ALOA（Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA)瓊脂
A.5.1 基礎培養基
A.5.1.1 成分
動(dòng)物組織的酶消化物 18 g
酪蛋白胰酶消化物 6 g
酵母提取物 10 g
丙酮酸鈉 2 g
葡萄糖 2 g
甘油磷酸鎂 1 g
無(wú)水硫酸鎂 0.5 g
氯化鈉 5 g
氯化鋰 10 g
無(wú)水磷酸氫鈉 2.5 g
5 -溴- 4 -氯-3吲哚-β-D吡喃葡萄糖苷 0.05 g
瓊脂 12 g～18 g(a)
蒸餾水 930 ml （b）
a 按瓊脂強度確定
b 如果用兩性霉素B為925ml蒸餾水（見(jiàn)A.5.5.2).
A.5.1.2 制法
上述成分進(jìn)行加熱溶解，調pH值7.2 ± 0.2，121°C 高壓滅菌15min。
A.5.2 萘啶酮酸溶液
萘啶酮酸鈉鹽 0.02 g
0.05mol/l的氫氧化鈉 5 ml
溶解萘啶酮酸鈉于5ml氫氧化鈉溶液中，通過(guò)0.45μm膜過(guò)濾，4°C保存備用。
A.5.3 頭孢他啶溶液
頭孢他啶 0.02 g
無(wú)菌蒸餾水 5 ml
溶解頭孢他啶于5ml無(wú)菌蒸餾水中，通過(guò)0.45μm膜過(guò)濾，4°C保存備用。
A.5.4 多粘菌素B
多粘菌素B硫酸鹽 76700 IU
無(wú)菌蒸餾水 5 ml
溶解多粘菌素B于5ml無(wú)菌蒸餾水中，通過(guò)0.45μm膜過(guò)濾，4°C保存備用。
A.5.5 抗生素添加劑
A.5.5.1 放線(xiàn)菌酮溶液
放線(xiàn)菌酮 0.05 g
乙醇 2.5 ml
無(wú)菌蒸餾水 2.5 ml
溶解放線(xiàn)菌酮于2.5ml乙醇溶液中，然后加入2.5ml的無(wú)菌蒸餾水混勻。通過(guò)0.45μm膜過(guò)濾，4°C保存備用。
A.5.5.2 兩性霉素B溶液（可以替代放線(xiàn)菌酮溶液）
兩性霉素B 0.01 g
1 mol/l 鹽酸（HCl (1 mol/l)） 2.5 ml
二甲基甲酰胺(DMF)） 7.5 ml
溶解兩性霉素在鹽酸/二甲基甲酰胺溶液中，通過(guò)0.45μm膜過(guò)濾，4°C保存備用。
注意---鹽酸/二甲基甲酰胺溶液有毒，小心使用。
A.5.6 補充劑
溶解2g L-α-磷脂酰肌醇于50 ml蒸餾水中，攪拌30min制成均勻懸浮液。121°C 高壓滅菌15min。冷卻至48°C～50°C，4°C保存備用。
A.5.7 完全培養基
A.5.7. 1成分
基礎培養基 930 ml(a)
萘啶酮酸鈉溶液 5 ml
頭孢他啶溶液 5 ml
多粘菌素B溶液 5 ml
放線(xiàn)菌酮溶液 5 ml
或兩性霉素B溶液 10 ml
補充劑 50 ml
a 如果使用兩性霉素B溶液就需要925ml
A.5.7.2 制法
將基礎培養基完全溶解，冷卻到50 ℃，加入上述各種溶液，混勻后傾倒在無(wú)菌的平皿中，備用。完全培養基的pH值應為7.2 ± 0.2。
A.6 革蘭氏染色液
A 6.1 結晶紫染色液
A.6.1.1 成分
|
結晶紫 |
1.0 g |
|
95％乙醇 |
20.0 mL |
|
1％草酸銨水溶液 |
80.0 mL |
A 6.1.2 制法
將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
A 6.2 革蘭氏碘液
A.6.2.1 成分
|
碘 |
1.0 g |
|
碘化鉀 |
2.0 g |
|
蒸餾水 |
300 mL |
A.6.2.2 制法
將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。
A.6.3 沙黃復染液
A.6.3.1 成分
|
沙黃 |
0.25 g |
|
95％乙醇 |
10.0 mL |
|
蒸餾水 |
90.0 mL |
A.6.3.2 制法
將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。
A.6.4 染色法
A.6.4.1 涂片用火焰固定后滴加結晶紫染液，作用1min, 水洗。
A.6.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。
A.6.4.3 滴加95％乙醇脫色，約15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗。
A.6.4.4 滴加復染液，復染1 min，水洗、待干、鏡檢。
A.7 SIM 動(dòng)力培養基
A 7.1 成分
胰胨 20.0 g
多價(jià)胨 6.0 g
硫酸鐵銨 0.2 g
硫代硫酸鈉 0.2 g
瓊脂 3.5 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.2
A.7.2 制法
將上述各成分加熱混勻，調節pH，分裝小試管，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。
A.7.3 試驗方法
挑取純培養的單個(gè)可疑菌落穿刺接種到SIM培養基中，于30 ℃培養24 h～48 h，觀(guān)察結果。
A.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和VP試驗用)
A.8.1 成分
多胨 7.0 g
葡萄糖 5.0 g
磷酸氫二鉀 5.0 g
蒸餾水 1 000 mL
A.1.1.1 pH 7.0成分
A.8.2 制法
溶化后調節pH，分裝試管，每管1 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。
A.8.3 甲基紅（MR）試驗
A.8.3.1 甲基紅試劑
A.8.3.1.1 成分
|
甲基紅 |
10 mg |
|
95 %乙醇 |
30 mL |
|
蒸餾水 |
20 mL |
A.8.3.1.2 制法
10 mg甲基紅溶于30 mL 95 %乙醇中，然后加入20 mL蒸餾水。
A.8.3.1.3 試驗方法
取適量瓊脂培養物接種于緩沖葡萄糖蛋白凍水中，36 ℃±1 ℃培養2 d～5 d。滴加甲基紅試劑一滴，立即觀(guān)察結果。鮮紅色為陽(yáng)性，黃色為陰性。
A.8.4 V-P試驗
A.8.4.1 6 % α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法：取α-萘酚6.0 g，加無(wú)水乙醇溶解，定容至100 mL。
A.8.4.2 40 %氫氧化鉀溶液
成分及制法：取氫氧化鉀40 g，加蒸餾水溶解，定容至100 mL。
A.8.4.3 試驗方法
取適量瓊脂培養物接種于緩沖葡萄糖蛋白凍水中，36 ℃±1 ℃培養2 d～4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氫氧化鉀溶液0.2 mL，充分振搖試管，觀(guān)察結果。陽(yáng)性反應立刻或于數分鐘內出現紅色，如為陰性，應放在36 ℃±1 ℃繼續培養1 h再進(jìn)行觀(guān)察。
A.9 血瓊脂
A.9.1 成分
蛋白胨 1.0 g
牛肉膏 0.3 g
氯化鈉 0.5 g
瓊脂 1.5 g
蒸餾水 100 mL
脫纖維羊血 5 mL～8 mL
A 9.2 制法
除新鮮脫纖維羊血外，加熱溶化上述各組分，121 ℃高壓滅菌15 min，冷到50 ℃，以無(wú)菌操作加入新鮮脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。
A.10 糖發(fā)酵管
A.10.1 成分
牛肉膏 5.0 g
蛋白胨 10.0 g
氯化鈉 3.0 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4×12H2O) 2.0 g
0.2%溴麝香草酚藍溶液 12.0 mL
蒸餾水 1 000 mL
A.10.2 制法
A.10.2.1 葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，按0.5 %比例加入葡萄糖,分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管內，調節pH至7.4，115 ℃高壓滅菌15 min，備用。
A.10.2.2 其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后，分裝每瓶100 mL，115 ℃高壓滅菌15 min。另將各種糖類(lèi)分別配好10%溶液，同時(shí)高壓滅菌。將5 mL糖溶液加入于100 mL培養基內，以無(wú)菌操作分裝小試管。
A.10.3 試驗方法
取適量純培養物接種于糖發(fā)酵管，36 ℃±1 ℃培養24 h～48 h，觀(guān)察結果，藍色為陰性，黃色為陽(yáng)性。
A.11 過(guò)氧化氫酶試驗
A.11.1 試劑
3%過(guò)氧化氫溶液：臨用時(shí)配制。
A.11.2 試驗方法
用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)菌落, 置于潔凈試管內，,滴加3%過(guò)氧化氫溶液2 mL，觀(guān)察結果。
A.11.3 結果
于半分鐘內發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性，不發(fā)生氣泡者為陰性。
A.12. 緩沖蛋白胨水（BPW）
A.12.1成分
蛋白胨 10.0g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O） 9.0 g
磷酸二氫鉀 1.5 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.2
A.12.2. 制法
加熱攪拌至溶解,調節pH，121 ℃高壓滅菌15 min。
附錄B
（規范性附錄）
單核細胞增生李斯特氏菌最可能數（MPN）檢索表
B.1 每g(mL)檢樣中單核細胞增生李斯特氏菌最可能數（MPN）
