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1. 范圍
本標準規定了食品中單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的檢驗方法。
本標準第一法適用于食品中單核細胞增生李斯特氏菌的定性檢驗；第二法適用于單核細胞
增生李斯特氏菌含量較高的食品中單核細胞增生李斯特氏菌的計數；第三法適用于單核細胞增
生李斯特氏菌含量較低而雜菌含量較高的食品中單核細胞增生李斯特氏菌的計數。
2. 設備和材料
注: 除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.2 恒溫培養箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃、20 ℃±1 ℃。
2.3 均質(zhì)器。
2.4 顯微鏡：10倍～100倍。
2.5 電子天平：感量0.1 g 。
2.6 錐形瓶：100 mL、500 mL。
2.7 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。
2.8 無(wú)菌平皿：直徑90 mm。
2.9 無(wú)菌試管：16 mm×160 mm。
2.10 離心管：30 mm×100 mm。
2.11 無(wú)菌注射器：1 mL。
2.12 單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ATCC19111或CMCC54004）、英諾克
李斯特氏菌（Listeria innocua ATCC33090）、伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii ATCC19119）、斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri ATCC35967）或具相同效果的標準株。
2.13 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923或其他產(chǎn)β-溶血環(huán)金葡菌）。
2.14 馬紅球菌（Rhodococcus equi ATCC6939或NCTC1621）。
2.15 小白鼠：ICR體重18 g～22 g。
2.16 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統。
3 培養基和試劑
3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）：見(jiàn)附錄A中A.1。
3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）：見(jiàn)附錄A中A.2。
3.3 李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）：見(jiàn)附錄A中A.3。
3.4 1%鹽酸吖啶黃（acriflavine HCl）溶液：見(jiàn)附錄A中A.3.2.1、A.3.2.2。
3.5 1%萘啶酮酸鈉鹽（naladixic acid）溶液：見(jiàn)附錄A中A.3.2.1、A.3.2.2。
3.6 PALCAM瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.4。
3.7 ALOA (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti)瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.5。
3.8 革蘭氏染液：見(jiàn)附錄A中A.6。
3.9 SIM動(dòng)力培養基：見(jiàn)附錄A中A.7。
3.10 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅（MR）和V-P試驗用]：見(jiàn)附錄A中A.8。
3.11 5%～8%羊血瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.9。
3.12 糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A中A.10。
3.13 過(guò)氧化氫試劑：見(jiàn)附錄A中A.11。
3.14 李斯特氏菌顯色培養基。
3.15 生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統。
3.16 緩沖蛋白凍水：見(jiàn)附錄A中A.12
第一法 單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗
4. 檢驗程序
單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗程序見(jiàn)圖1。
5 操作步驟
5.1 增菌
以無(wú)菌操作取樣品25 g（mL）加入到含有225 mL LB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續均質(zhì)1 min～2 min；或放入盛有225 mL LB1增菌液的均質(zhì)杯中，以8000 r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2 min。于30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，移取0.1 mL，轉種于10 mL LB2增菌液內，于30 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。
5.2 分離
取LB2 二次增菌液劃線(xiàn)接種于李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板和PALCAM瓊脂平板，于36 ℃±1 ℃培養24 h～48 h，觀(guān)察各個(gè)平板上生長(cháng)的菌落。典型菌落在ALOA瓊脂平板上為藍綠色菌落周?chē)胁煌该鲿炄Γ?/span>在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周?chē)凶睾谏馊�，有些菌落有黑色凹�?/span>；在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定。
注： ALOA平板上的典型菌落為單核細胞增生李斯特氏菌或伊氏李斯特氏菌；如果ALOA平板上菌落不典型，可繼續培養48 h，再觀(guān)察。部分菌株不產(chǎn)生透明暈圈。
5.3 初篩
自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)～5個(gè)典型或可疑菌落，在TSA-YE平板上劃線(xiàn)純化, 于36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h,分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養物繼續進(jìn)行鑒定。
5.4 鑒定
5.4.1 染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小為（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀(guān)察，該菌出現輕微旋轉或翻滾樣的運動(dòng)。
5.4.2 動(dòng)力試驗：挑取純培養的單個(gè)可疑菌落穿刺半固體或SIM動(dòng)力培養基，于25℃～30℃培養48h，李斯特氏菌有動(dòng)力，在半固體或SIM培養基上方呈傘狀生長(cháng)，如傘狀生長(cháng)不明顯，可繼續培養5d,再觀(guān)察結果。
5.4.3 生化鑒定：挑取純培養的單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應的菌落繼續進(jìn)行糖發(fā)酵試驗和MR-VP試驗。單核細胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見(jiàn)表1。
5.4.4 溶血試驗：將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20個(gè)～25個(gè)小格，挑取純培養的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽(yáng)性對照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌)，穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂，36 ℃±1 ℃培養24 h～48 h，于明亮處觀(guān)察，單增李斯特氏菌呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)a(chǎn)生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區域，若結果不明顯，可置4℃冰箱24 h～48 h再觀(guān)察。
注：也可用劃線(xiàn)接種法。
5.4.5 協(xié)同溶血試驗 cAMP(可選項目)：在羊血瓊脂平板上平行劃線(xiàn)接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養的單個(gè)可疑菌落垂直劃線(xiàn)接種于平行線(xiàn)之間，垂直線(xiàn)兩端不要觸及平行線(xiàn)，距離1mm～2mm，同時(shí)接種單核細胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，于36 ℃±1 ℃培養24 h～48 h。單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現約2mm的β-溶血增強區域，斯氏李斯特氏菌也出現微弱的溶血增強區域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現約5mm～10mm的“箭頭狀”β-溶血增強區域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現象。若結果不明顯，可置4℃冰箱24 h～48 h再觀(guān)察。
5.5 可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統等對木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養物進(jìn)行鑒定。
5.6 小鼠毒力試驗（可選項目）
將符合上述特性的純培養物接種于TSB-YE中，于36 ℃±1 ℃培養24 h，4 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無(wú)菌生理鹽水制備成濃度為1010 CFU/mL的菌懸液，取此菌懸液對3只～5只小鼠進(jìn)行腹腔注射，每只0.5 mL，同時(shí)觀(guān)察小鼠死亡情況。接種致病株的小鼠于2 d～5 d內死亡。試驗設單增李斯特氏菌致病株和滅菌生理鹽水對照組。單核細胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌對小鼠有致病性。
5.7 結果與報告
綜合以上生化試驗和溶血試驗的結果,報告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出單核細胞增生李斯特氏菌。
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