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1 范圍
本標準規定了食品中肉毒梭菌（Clostridium botulinum）及肉毒毒素（botulinum Toxin）的檢驗方法。
本標準適用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
a）冰箱：2℃～5℃、-20℃;
b）天平：感量0.1g;
c）無(wú)菌手術(shù)剪、鑷子、試劑勺；
d）均質(zhì)器或無(wú)菌乳缽；
e）離心機：3000 rpm、14000 rpm
f）厭氧培養裝置；
g）恒溫培養箱：35℃±1℃、28℃±1℃；
h）恒溫水浴箱：37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃；
i）顯微鏡：10倍×100倍
j）PCR儀；
k）電泳儀或毛細管電泳儀；
l）凝膠成像系統或紫外檢測儀；
m）核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計；
n）可調微量移液器：0.2µL～2µL、2µL～20µL、20µL～200µL、100µL～1000µL；
o）無(wú)菌吸管：1.0mL、10.0 mL、25 .0mL；
p）無(wú)菌錐形瓶：100 mL；
q）培養皿：直徑90mm；
r）離心管：50mL、1.5mL；
s）PCR反應管；
t）無(wú)菌注射器：1.0mL；
u）小鼠：15g～20g，每一批次試驗應使用同一品系的KM或ICR小鼠。
3 培養基和試劑
除另有規定外，PCR試驗所用試劑為分析純或符合生化試劑標準，水應符合GB/T6682中一級水的規格。
3.1 庖肉培養基：見(jiàn)附錄A中A.1。
3.2 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯（TPGYT）：見(jiàn)附錄A中A.2。
3.3 卵黃瓊脂培養基：見(jiàn)附錄A中A.3。
3.4 明膠磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)附錄A中A.4。
3.5 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中A.5。
3.6 10%胰蛋白酶溶液：見(jiàn)附錄A中A.6。
3.7 磷酸鹽緩沖液（PBS）：見(jiàn)附錄A中A.7。
3.8 1mol/L氫氧化鈉。
3.9 1mol/L鹽酸。
3.10 肉毒毒素診斷血清。
3.11 無(wú)水乙醇和95%乙醇。
3.12 10mg/mL溶菌酶溶液。
3.13 10mg/mL蛋白酶K溶液。
3.14 3mol/L 乙酸鈉溶液（pH5.2）。
3.15 TE緩沖液。
3.16 引物：根據表1中序列合成，臨用時(shí)用超純水配制引物濃度為10 µmol/L。
3.17 10×PCR緩沖液。
3.18 25mmol/LMgCl2。
3.19 dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGCP。
3.20 Taq酶。
3.21 瓊脂糖：電泳級。
3.22 溴化乙錠或Goldview。
3.23 5×TBE緩沖液。
3.24 6×加樣緩沖液。
3.25 DNA分子量標準。
4 檢驗程序
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序見(jiàn)圖1。
5 操作步驟
5.1 樣品制備5.1.1 樣品保存
待檢樣品（除未打開(kāi)的正常罐頭食品）和明顯膨脹的罐頭食品應放2℃～5℃冰箱冷藏，直至檢驗。
5.1.2 固態(tài)食品
固體或游離液體很少的半固態(tài)食品，以無(wú)菌操作稱(chēng)取樣品25g，放入無(wú)菌均質(zhì)袋或無(wú)菌乳缽，塊狀食品用無(wú)菌刀剪切碎，含水量較高的固態(tài)食品加入25mL明膠磷酸鹽緩沖液，乳粉、牛肉干等含水量低的食品加入50mL明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡30分鐘，用拍擊式均質(zhì)器拍打2min或用無(wú)菌研杵研磨制備樣品勻液，收集備用。
5.1.3 液態(tài)食品
液態(tài)食品搖勻，直接量取25mL檢驗。
5.1.4 樣品處理
取樣后的剩余樣品放2℃～5℃冰箱冷藏，直至檢驗結果報告發(fā)出后，按感染性廢棄物要求進(jìn)行無(wú)害化處理，檢出陽(yáng)性的樣品應采用壓力蒸汽滅菌方式進(jìn)行無(wú)害化處理。
5.2 肉毒毒素檢測
5.2.1 毒素液制備
取樣品勻液約40mL或均勻液體樣品25mL放入離心管，3000r/min，10min～20min離心，收集上清液分為兩份放入無(wú)菌試管中，一份直接用于毒素檢測，一份用于胰酶處理后進(jìn)行毒素檢測，液體樣品保留底部沉淀液約12mL備用。
胰酶處理：用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調節上清液pH至6.2，按9份上清液加1份10%胰酶（活力1:250）水溶液，混勻，37℃孵育60min，期間間或輕輕搖動(dòng)反應液。
5.2.2 檢出試驗
用5號針頭注射器取離心上清液和胰酶處理上清液分別腹腔注射小鼠三只，每只0.5mL，觀(guān)察和記錄小鼠48h中毒表現。小鼠在24h內出現肉毒毒素中毒典型癥狀，多數在6h內發(fā)病和死亡，其主要表現為豎毛、呼吸困難、四肢癱軟，呈現風(fēng)箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如蜂腰，因呼吸衰竭而死亡，可初步判定為毒素檢出。若小鼠在24h后發(fā)病或死亡，應仔細觀(guān)察小鼠癥狀，必要時(shí)濃縮上清液重復試驗，以排除肉毒毒素中毒。若小鼠出現猝死（30min內）導致癥狀不明顯時(shí)，可將毒素上清液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)貜驮囼灐?/span>
注：毒素檢測動(dòng)物試驗應遵循《食品毒理學(xué)實(shí)驗室操作規范》（GB15193.2）的規定。
5.2.3 確證試驗
上清液或（和）胰酶處理上清液的毒素檢出試驗陽(yáng)性者，取相應試驗液三份，每份0.5mL，其中第一份加等量多型混合肉毒毒素診斷血清，混勻，37℃孵育30min；第二份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min；第三份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻。將三份混合液分別腹腔注射小鼠各兩只，每只0.5mL，觀(guān)察96h。
結果判定：若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡，而第三份混合液小鼠發(fā)病死亡，并出現肉毒毒素中毒的特有癥狀，則判定檢測樣品中檢出肉毒毒素。
5.2.4 毒力測定（選做項目）
取確證試驗陽(yáng)性的試驗液，用明膠磷酸鹽緩沖液稀釋制備一定倍數稀釋液，如10倍、50倍、100倍、500倍等，分別腹腔注射小鼠各兩只，每只0.5mL，觀(guān)察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至96h，計算最低致死劑量MLD/mL或MLD/g，評估樣品中肉毒毒素毒力，MLD等于小鼠全部死亡的最高稀釋倍數乘以樣品試驗液稀釋倍數。例如，樣品稀釋兩倍制備的上清液，再稀釋100倍試驗液使小鼠全部死亡，而500倍稀釋液組存活，則該樣品毒力為200MLD/g。
5.2.5 定型試驗（選做項目）
根據毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩沖液將上清液稀釋至10～1000MLD/mL作為定型試驗液，分別與各單型肉毒毒素診斷血清等量混合（國產(chǎn)診斷血清一般為凍干血清，用1mL生理鹽水溶解，能中和10000LD50的相應毒素），37℃孵育30min，分別腹腔注射小鼠兩只，每只0.5mL，觀(guān)察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至96h。同時(shí)，用明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與試驗液等量混合作為小鼠試驗對照。
結果判定：某一單型診斷血清組動(dòng)物未發(fā)病且正常存活，而對照組和其他單型診斷血清組動(dòng)物發(fā)病死亡，則判定樣品中所含肉毒毒素為該型肉毒毒素。
注：未經(jīng)胰酶激活處理的樣品上清液的毒素檢出試驗或確證試驗為陽(yáng)性者，則毒力測定和定型試驗可省略胰酶激活處理試驗。
5.3 肉毒梭菌檢驗
5.3.1 增菌培養與檢出試驗
5.3.1.1 取出庖肉培養基4支和TPGY肉湯管2支，隔水煮沸10min-15min，排除溶解氧，迅速冷卻，切勿搖動(dòng)，在TPGY肉湯管中緩慢加入胰酶液至液體石蠟液面下肉湯中，每支1mL，制備成TPGYT。
5.3.1.2 吸取樣品勻液或毒素制備過(guò)程中的離心沉淀液2mL接種至庖肉培養基中，每份樣品接種4支，2支直接放置35℃±1℃厭氧培養至5d，另2支放80℃保溫10min，再放置35℃±1℃厭氧培養至5d；同樣方法接種2支 TPGYT肉湯管， 28℃±1℃厭氧培養至5d。接種時(shí)將樣品液吸管慢慢穿過(guò)肉湯液面接種到肉湯管底部，切勿攪動(dòng)。
5.3.1.3 檢查記錄增菌培養物的濁度、產(chǎn)氣、肉渣顆粒消化情況，并注意氣味。肉毒梭菌培養物為產(chǎn)氣、肉湯渾濁（庖肉培養基中A型和B型肉毒梭菌肉湯變黑）、消化或不消化肉粒、有異臭味。
5.3.1.4 將增菌培養物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀(guān)察菌體形態(tài)，注意是否有芽胞、芽胞的相對比例、芽胞在細胞內的位置。
5.3.1.5 若增菌培養物5d無(wú)菌生長(cháng),應延長(cháng)培養至10d，觀(guān)察生長(cháng)情況。
5.3.1.6 取增菌培養物陽(yáng)性管的上清液，按5.2方法進(jìn)行毒素檢出和確證試驗，必要時(shí)進(jìn)行定型試驗，陽(yáng)性結果可證明樣品中有肉毒梭菌存在。
注：TPGYT增菌液的毒素試驗無(wú)需添加胰酶處理。
5.3.2 分離與純化培養
5.3.2.1 增菌液前處理，吸取1mL增菌液至無(wú)菌螺旋帽試管中，加入等體積過(guò)濾除菌的無(wú)水乙醇，混勻，在室溫下放置1h。
5.3.2.2 取增菌培養物和經(jīng)乙醇處理的增菌液分別劃線(xiàn)接種至卵黃瓊脂平板，35℃±1℃厭氧培養48h。
5.3.2.3 觀(guān)察平板培養物菌落形態(tài)，肉毒梭菌菌落隆起或扁平、光滑或粗糙，易成蔓延生長(cháng)，邊緣不規則，在菌落周?chē)纬扇樯恋頃炄Γ?/span>E型較寬，AB型較窄），用斜視光觀(guān)察，菌落表面呈現珍珠樣彩虹，這種光澤區可隨蔓延生長(cháng)擴散到不規則邊緣區外的暈圈。
5.3.2.4 菌株純化培養，在分離培養平板上選擇5個(gè)肉毒梭菌可疑菌落，分別接種卵黃瓊脂平板，35℃±1℃，厭氧培養48h，按5.3.2.3觀(guān)察菌落形態(tài)及其純度。
5.3.3 鑒定試驗
5.3.3.1 染色鏡檢
挑取可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色和鏡檢，肉毒梭菌菌體形態(tài)為革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌、芽胞卵圓形、大于菌體、位于次端，菌體呈網(wǎng)球拍狀。
5.3.3.2 毒素基因檢測（PCR快速鑒定）
a）菌株活化：挑取可疑菌落或待鑒定菌株接種TPGY，35℃±1℃厭氧培養24h。
b）DNA模板制備：吸取TPGY培養液1.4mL至無(wú)菌離心管中， 14000g離心２min，棄上清，加入1.0mLPBS懸浮菌體，14000g離心２min，棄上清，用400µL PBS重懸沉淀，加入10mg/mL溶菌酶溶液100µL，搖勻，37℃水浴15min，加入10mg/mL蛋白酶K溶液10µL，搖勻，60℃水浴1h，再沸水浴10min，14000g離心２min，上清液轉移至無(wú)菌小離心管中，加入3mol/LNaAc溶液50µL和95%乙醇1.0mL，搖勻，-70℃或-20℃放置30min，14000g離心10min，棄去上清液，沉淀干燥后溶于200µLTE緩沖液，置于-20°C保存備用。
注：根據實(shí)驗室實(shí)際情況，也可采用常規水煮沸法或商品化試劑盒制備DNA模板。
c）核酸濃度測定（必要時(shí)）：取5µLDNA模板溶液，加超純水稀釋至1mL，用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm波段的吸光值A260和A280。按式（1）計算DNA濃度。當濃度在0.34µg/mL～340µg/mL或A260/A280比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴增。
C= A260×N×50 ………………………(1)
式中：
C—DNA濃度，單位為µg/mL；
A260—260nm處的吸光值；
N—核酸稀釋倍數。
d）PCR擴增
1）采用分別針對Ａ型、Ｂ型、Ｅ型和Ｆ型肉毒梭菌毒素基因設計的特異性引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR擴增，每個(gè)PCR反應管檢測一種型別的肉毒梭菌。
2）反應體系配制見(jiàn)表2，反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進(jìn)行相應調整。
3）反應程序，預變性95℃、５min；循環(huán)參數94℃、１min，60℃、１min，72℃、１min；循環(huán)數40；后延伸72℃，10min；4℃保存備用。
4）PCR擴增體系應設置陽(yáng)性對照、陰性對照和空白對照。用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉毒毒素基因的質(zhì)控品作陽(yáng)性對照、非肉毒梭菌基因組DNA作陰性對照、無(wú)菌水作空白對照。
e）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，用0.5×TBE緩沖液配制1.2～1.5的瓊脂糖凝膠，凝膠加熱融化后冷卻至60℃左右加入溴化乙錠至0.5µg/mL或Goldview5µL/100mL制備膠塊，取10µLPCR擴增產(chǎn)物與2.0µL6×加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣，其中一孔加入DNA分子量標準。0.5×TBE電泳緩沖液，10V/cm恒壓電泳，根據溴酚藍的移動(dòng)位置確定電泳時(shí)間，用紫外檢測儀或凝膠成像系統觀(guān)察和記錄結果。
PCR擴增產(chǎn)物也可采用毛細管電泳儀進(jìn)行檢測。
f）結果判定，陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽(yáng)性對照出現預期大小的擴增條帶（表1），判定本次PCR檢測成立；待測樣品出現預期大小的擴增條帶，判定為PCR結果陽(yáng)性，根據表1判定肉毒梭菌菌株型別，待測樣品未出現預期大小的擴增條帶，判定PCR結果為陰性。
5.3.3.3 菌株產(chǎn)毒試驗
將PCR陽(yáng)性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接種庖肉培養基或TPGYT肉湯（用于E型肉毒梭菌），按5.3.1.2條件厭氧培養5d，按5.2方法進(jìn)行毒素檢測和（或）定型試驗，毒素確證試驗陽(yáng)性者，判定為肉毒梭菌，根據定型試驗結果判定肉毒梭菌型別。
注：根據PCR陽(yáng)性菌株型別，可直接用相應型別的肉毒毒素診斷血清進(jìn)行確證試驗。
6 結果報告
6.1 肉毒毒素檢測結果報告
根據5.2.3確證試驗結果，報告25g(mL)樣品中檢出或未檢出肉毒毒素。
根據5.2.5定型試驗結果，報告25g(mL)樣品中檢出某型肉毒毒素。
6.2 肉毒梭菌檢驗結果報告
根據5.3.3.2 PCR檢測結果陰性，報告樣品中未檢出肉毒梭菌。
根據5.3.3.3菌株產(chǎn)毒試驗結果，報告樣品中檢出肉毒梭菌或某型肉毒梭菌或未檢出肉毒梭菌。
