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1 范圍
本標準規定了食品中致瀉大腸埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli)的檢驗方法。
本標準適用于食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗。
2 術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)
2.1 術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
2.1.1 致瀉大腸埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichia coli
一類(lèi)能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希氏菌，可經(jīng)過(guò)污染食物引起人類(lèi)發(fā)病。常見(jiàn)的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（包括腸道出血性大腸埃希氏菌）和腸道集聚性大腸埃希氏菌。
2.1.2 腸道致病性大腸埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichia coli
能夠引起宿主腸粘膜上皮細胞黏附及擦拭性損傷，且不產(chǎn)生志賀毒素的大腸埃希氏菌。它是發(fā)展中國家嬰幼兒腹瀉的主要病原菌，有高度傳染性，嚴重者可致死。EPEC的致病機制包括局限性粘附、信號傳導和緊密粘附。其中，局限性粘附由存在于EAF質(zhì)粒上的束狀菌毛基因bfp介導，位于LEE毒力島上的III型分泌系統編碼基因esc參與信號傳導，引起微絨毛結構消失；而緊密粘附由外膜蛋白緊密素介導，緊密素由eae基因編碼。
2.1.3 腸道侵襲性大腸埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coli
能夠侵入腸道上皮細胞而引起痢疾樣腹瀉的大腸埃希氏菌。該菌不像典型的大腸埃希氏菌，無(wú)動(dòng)力、不發(fā)生賴(lài)氨酸脫羧反應、不發(fā)酵乳糖，生化反應和抗原結構均近似痢疾志賀氏菌。侵入上皮細胞的關(guān)鍵基因是侵襲性質(zhì)粒上的抗原編碼基因及其調控基因，如ipaH基因、ipaR基因（又稱(chēng)為invE基因）。
2.1.4 產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichia coli
能夠分泌熱穩定性腸毒素或/和熱不穩定性腸毒素的大腸埃希氏菌。熱穩定性腸毒素按照來(lái)源不同分為豬源熱穩定性腸毒素和人源熱穩定性腸毒素，編碼基因分別為stp（又稱(chēng)為stIa）和sth（又稱(chēng)為stIb）；熱不穩定性腸毒素編碼基因為lt。兩種腸毒素基因在產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌中可以單獨存在，也可以同時(shí)存在。該菌可引起嬰幼兒和旅游者腹瀉，一般呈輕度水樣腹瀉，也可呈嚴重的霍亂樣癥狀，低熱或不發(fā)熱。腹瀉常為自限性，一般2～3天即自愈。
2.1.5 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌 Shiga toxin-producing Escherichia coli（腸道出血性大腸埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichia coli）
能夠分泌志賀毒素、引起宿主腸粘膜上皮細胞黏附及擦拭性損傷的大腸埃希氏菌。志賀毒素的編碼基因為stx，志賀毒素分為兩種類(lèi)型，其編碼基因分別為stx1和stx2，相互間無(wú)免疫交叉反應。stx1和stx2 在產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌中可以單獨存在，也可以同時(shí)存在。宿主腸粘膜上皮細胞黏附及擦拭性損傷表現為微絨毛結構消失和緊密粘附，分別由esc編碼的III型分泌系統和eae編碼的緊密素介導。另外，有些產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌在臨床上引起人類(lèi)出血性結腸炎（HC）或血性腹瀉，并可進(jìn)一步發(fā)展為溶血性尿毒綜合征（HUS），這類(lèi)產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌為腸道出血性大腸埃希氏菌。
2.1.6 腸道集聚性大腸埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichia coli
腸道集聚性大腸埃希氏菌不侵入腸道上皮細胞，但能引起腸道液體蓄積。不產(chǎn)生熱穩定性腸毒素或熱不穩定性腸毒素，也不產(chǎn)生志賀毒素。唯一特征是能對Hep-2細胞形成集聚性粘附，也稱(chēng)Hep-2細胞粘附性大腸埃希氏菌。
2.2 縮略語(yǔ)
下列縮略語(yǔ)適用于本文件。
2.2.1 DEC：致瀉大腸埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichia coli
2.2.2 EPEC：腸道致病性大腸埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichia coli
2.2.3 EIEC：腸道侵襲性大腸埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coli
2.2.4 ETEC：產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichia coli
2.2.5 STEC：產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌 Shiga toxin-producing Escherichia coli
2.2.6 EHEC：腸道出血性大腸埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichia coli
2.2.7 EAEC：腸道集聚性大腸埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichia coli
2.2.8 escV：蛋白分泌物調節基因，gene encoding LEE-encoded type III secretion system factor
2.2.9 eae：緊密素基因，gene encoding intimin for Escherichia coli attaching and effacing
2.2.10 bfpB：束狀菌毛B基因，bundle-forming pilus B；
2.2.11 stx1：志賀毒素Ⅰ基因，Shiga toxin one
2.2.12 stx2：志賀毒素Ⅱ基因，Shiga toxin two
2.2.13 lt：熱不穩定性腸毒素基因，heat-labile enterotoxin
2.2.14 st：熱穩定性腸毒素基因，heat-stable enterotoxin
2.2.15 stp（stIa）：豬源熱穩定性腸毒素基因，heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from pigs
2.2.16 sth（stIb）：人源熱穩定性腸毒素基因，heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from human
2.2.17 invE：侵襲性質(zhì)粒調節基因，invasive plasmid regulator；
2.2.18 ipaH：侵襲性質(zhì)�？乖璈基因，invasive plasmid antigen H-gene；
2.2.19 aggR：集聚粘附菌毛調節基因，aggregative adhesive fimbriae regulator；
2.2.20 uidA：β-葡萄糖苷酶基因，β-glucuronidase gene；
2.2.21 astA：集聚熱穩定性毒素A基因，enteroaggregative heat-stable enterotoxin A；
2.2.22 pic：腸定植因子基因，protein involved in intestinal colonization；
2.2.23 LEE：腸細胞損傷基因座，Locus of enterocyte effacement
2.2.24 EAF：EPEC黏附因子，EPEC adhesive factor
3 設備和材料
除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
a）恒溫培養箱： 36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃；
b）冰箱：2 ℃～5 ℃；
c）恒溫水浴箱：100℃，50℃±1 ℃；
d) 電子天平：感量0.1 g，感量0.01 g；
e）顯微鏡：10倍～100倍；
f）均質(zhì)器；
g）振蕩器；
h）無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度），10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭；
i）無(wú)菌均質(zhì)杯或無(wú)菌均質(zhì)袋：容量 500 mL；
j）無(wú)菌培養皿：直徑90 mm；
k）pH計或精密pH試紙；
l）微量離心管：1.5 mL/2.0 mL；
m）低溫高速離心機；
n）全自動(dòng)微生物生化鑒定系統；
o）PCR儀；
p）水平電泳儀；
q）8聯(lián)排管和8聯(lián)排蓋（平蓋/凸蓋）；
r）凝膠成像儀。
4 培養基和試劑
4.1 營(yíng)養肉湯：見(jiàn)附錄A 中A.1。
4.2 腸道菌增菌肉湯：見(jiàn)附錄A 中A.2。
4.3 麥康凱瓊脂（MAC）：見(jiàn)附錄A 中A.3。
4.4伊紅美藍瓊脂（EMB）：見(jiàn)附錄A 中A.4。
4.5 三糖鐵（TSI）瓊脂：見(jiàn)附錄A 中A.5。
4.6 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：見(jiàn)附錄A 中A.6。
4.7 半固體瓊脂：見(jiàn)附錄 A 中 A.7。
4.8 尿素瓊脂（pH 7.2）：見(jiàn)附錄 A 中 A.8。
4.9 氰化鉀 （KCN） 培養基：見(jiàn)附錄 A 中 A.9。
4.10 氧化酶試劑：見(jiàn)附錄 A 中 A.10。
4.11 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中A.11。
4.12 BHI肉湯：見(jiàn)附錄A中A.12。
4.13 福爾馬林（含38%～40%甲醛）。
4.14 生化鑒定試劑盒。
4.15 致瀉大腸埃希氏菌PCR試劑盒。
4.16 大腸埃希氏菌診斷血清。
5 檢驗程序
致瀉大腸埃希氏菌檢驗程序見(jiàn)圖1。
6 操作步驟
6.1增菌
以無(wú)菌操作取檢樣25 g（或25 mL）,加入裝有滅菌225 mL營(yíng)養肉湯的均質(zhì)杯中，用旋轉刀片式均質(zhì)器以8 000 r/min～10 000 r/min均質(zhì)1 min～2 min；或加入裝有225 mL營(yíng)養肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min～2 min。液體樣品振蕩混勻即可。于36 ℃±１℃培養6 h。取10 μL，接種于30 mL腸道菌增菌肉湯管內，于42 ℃±１℃培養18 h。
6.2 分離
將增菌液劃線(xiàn)接種MAC和EMB瓊脂平板，于36 ℃ ± 1 ℃培養18 h～24 h，觀(guān)察菌落特征。在MAC瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為磚紅色，不分解乳糖的菌落為無(wú)色或淡粉色；在EMB瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤，不分解乳糖的菌落為無(wú)色或淡粉色。不但要挑取乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也要挑取乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。
6.3 生化試驗
6.3.1 選取平板上可疑菌落10個(gè)～20個(gè)（10個(gè)以下全選），分別接種TSI。同時(shí)將這些培養物分別接種蛋白胨水、尿素瓊脂（pH 7.2）和KCN肉湯。于36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。
6.3.2 TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，靛基質(zhì)陽(yáng)性，H2S陰性和尿素酶陰性的培養物為大腸埃希氏菌。TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽(yáng)性的培養物，均非大腸埃希氏菌。必要時(shí)做革蘭氏染色和氧化酶試驗。大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性。
6.3.3 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統，可從營(yíng)養瓊脂平板上挑取可疑菌落用0.85%滅菌生理鹽水制備成濁度適當的菌懸液，使用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統進(jìn)行鑒定。
6.4 PCR確認試驗
6.4.1 取生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行PCR確認試驗。
6.4.2 使用1 μL取菌環(huán)刮取營(yíng)養瓊脂平板或斜面上培養18 h～24 h的菌落，懸浮在200 μL0.85%滅菌生理鹽水中，充分打散制成菌懸液，于13000 rpm離心3 min，棄掉上清液。加入1mL滅菌去離子水充分混勻菌體，于100 °C水浴或者金屬浴維持10 min；冰浴冷卻后，13000 rpm離心3 min，收集上清液；按1:10的比例用滅菌去離子水稀釋上清液，取2 µL作為PCR檢測的模板；所有處理后的DNA模板在-20°C以下保存備用。也可用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
6.4.3 每次PCR反應使用EPEC、EIEC、STEC/ETEC、EHEC、EAEC標準菌株作為陽(yáng)性對照。同時(shí)，使用大腸埃希氏菌ATCC 25922陰性對照控制PCR體系污染。致瀉大腸埃希氏菌特征性基因見(jiàn)表1。
表1 五種致瀉大腸埃希氏菌特征基因
|
致瀉大腸埃希氏菌類(lèi)別 |
特征性基因 |
|
|
EPEC |
escV或eae、bfpB |
uidA |
|
STEC/EHEC |
escV或eae、stx1、stx2 |
|
|
EIEC |
invE或ipaH |
|
|
ETEC |
lt、stp、sth |
|
|
EAEC |
astA、aggR、pic |
|
6.4.4 聚合酶鏈反應（PCR）方法鑒定五種致瀉大腸埃希氏菌的操作可參考附錄B。
6.4.5 如用商品化PCR試劑盒或多重聚合酶鏈反應（MPCR）試劑盒，應按照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和結果判定。
6.5 血清學(xué)試驗（選做項目）
注：應按照生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行O抗原和H抗原的鑒定。當生產(chǎn)商的使用說(shuō)明與下面的描述可能有偏差時(shí)，按生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。
6.5.1 取PCR試驗確認為致瀉大腸埃希氏菌的菌株進(jìn)行血清學(xué)試驗。
6.5.2 O抗原鑒定
6.5.2.1假定試驗：挑取經(jīng)生化試驗和PCR試驗證實(shí)為致瀉大腸埃希氏菌的營(yíng)養瓊脂平板上的菌落，根據致瀉大腸埃希氏菌的類(lèi)別，選用大腸埃希氏菌單價(jià)或多價(jià)OK血清做玻片凝集試驗。當與某一種多價(jià)OK血清凝集時(shí)，再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)OK血清做凝集試驗。致瀉大腸埃希氏菌所包括的O抗原群見(jiàn)表2。如與某一單價(jià)OK血清呈現凝集反應，即為假定試驗陽(yáng)性。
6.5.2.2證實(shí)試驗：用0.85%滅菌生理鹽水制備O抗原懸液，稀釋至與Mac Farland 3號比濁管相當的濃度。原效價(jià)為1:160～1:320的O血清，用0.5%鹽水稀釋至1:40。將稀釋血清與抗原懸液于10 mm×75 mm試管內等量混合，做單管凝集試驗�；靹蚝蠓庞�50 ℃±1 ℃水浴箱內，經(jīng)16 h后觀(guān)察結果。如出現凝集，可證實(shí)為該O抗原。
表2 致瀉大腸埃希氏菌主要的O抗原
|
DEC類(lèi)別 |
DEC主要的O抗原 |
|
EPEC |
O26 O55 O86 O111ab O114 O119 O125ac O127 O128ab O142 O158等 |
|
STEC/EHEC |
O4 O26 O45 O91 O103 O104 O111 O113 O121 O128 O157 等 |
|
EIEC |
O28ac O29 O112ac O115 O124 O135 O136 O143 O144 O152 O164 O167等 |
|
ETEC |
O6 O11 O15 O20 O25 O27 O63 O78 O85 O114 O115 O26 O128ac O148 O149 O159 O166 O167等 |
|
EAEC |
O9 O62 O73 O101 O134等 |
6.5.3 H 抗原鑒定
6.5.3.1 取菌株穿刺接種半固體瓊脂管，36 ℃ ± 1 ℃培養18 h～24 h，取頂部培養物1環(huán)接種至BHI 液體培養基中，于36 ℃ ± 1 ℃培養18 h～24 h。加入福爾馬林至終濃度為0.5%，做玻片凝集或試管凝集試驗。
6.5.3.2 若待測抗原與血清均無(wú)明顯凝集，應從首次穿刺培養管中挑取培養物，再進(jìn)行2～3次半固體管穿刺培養，按照6.5.3.1進(jìn)行試驗。
6.6 結果報告
6.6.1根據生化試驗、PCR確認試驗的結果，報告25 g（或mL）樣品中檢出或未檢出某類(lèi)致瀉大腸埃希氏菌。
6.6.2如果進(jìn)行血清學(xué)試驗，根據血清學(xué)試驗的結果，報告25 g（或mL）樣品中檢出的某類(lèi)致瀉大腸埃希氏菌血清型別。
附錄A
培養基和試劑
A.1 營(yíng)養肉湯
A.1.1 成分
|
蛋白胨 |
10.0g |
|
牛肉膏 |
3.0g |
|
氯化鈉 |
5.0g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
|
pH7.4±0.2 |
|
A.1.2 制法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分裝適當的容器。121 °C 滅菌15 min。
A.1 腸道菌增菌肉湯
A.1.1 成分
|
蛋白胨 |
10.0g |
|
葡萄糖 |
5.0g |
|
牛膽鹽 |
20.0g |
|
磷酸氫二鈉 |
8.0g |
|
磷酸二氫鉀 |
2.0g |
|
煌綠 |
0.015g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
|
pH7.2±0.2 |
|
A.1.2 制法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.2±0.2，分裝每瓶30 mL。115 °C 滅菌20 min。
A.3 麥康凱瓊脂（MAC）
A.3.1 成分
|
蛋白胨 |
20.0g |
|
乳糖 |
10.0g |
|
3號膽鹽 |
1.5g |
|
氯化鈉 |
5.0g |
|
中性紅 |
0.03g |
|
結晶紫 |
0.001g |
|
瓊脂 |
15.0g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH7.2±0.2
A.3.2 制法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.2±0.2，分裝。121℃高壓滅菌15min。冷卻至45 ℃～50 ℃，傾注平板。
注：如不立即使用，在2 ℃~8 ℃條件下可儲存二周。
A.4 伊紅美藍（EMB）瓊脂
A.4.1 成分
|
蛋白胨 |
10.0g |
|
乳糖 |
10.0 g |
|
磷酸氫二鉀（K2HPO4） |
2.0g |
|
瓊脂 |
15.0g |
|
2%伊紅Y水溶液 |
20.0mL |
|
0.5%美藍水溶液 |
13.0mL |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH7.1±0.2
A.4.2 制法
在1 000 mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和乳糖，加水補足，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.1±0.2。再加入瓊脂， 121 ℃高壓滅菌15 min。冷至45 ℃～50 ℃，加入2％伊紅Y水溶液和0.5％美藍水溶液，搖勻，傾注平皿。
A.5 三糖鐵瓊脂（TSI）
A.5.1 成分
|
蛋白胨 |
20.0 g |
|
牛肉浸膏 |
5.0 g |
|
乳糖 |
10.0g |
|
蔗糖 |
10.0 g |
|
葡萄糖 |
1.0 g |
|
硫酸亞鐵銨[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O] |
0.2 g |
|
氯化鈉 |
5.0g |
|
硫代硫酸鈉 |
0.2g |
|
酚紅 |
0.025 g |
|
瓊脂 |
12.0 g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH 7.4±0.2
A.5.2 制法
除酚紅和瓊脂外，將其它成分加于400 mL水中，攪拌均勻，靜置約10 min，加熱使完全溶化， 冷卻至25 ℃左右校正pH至 7.4±0.2。另將瓊脂加于600 mL水中，靜置約10 min，加熱使完全溶化。將兩溶液混合均勻，加入5%酚紅水溶液5 mL，混勻，分裝小號試管，每管約3 mL。于121 °C 滅菌15 min，制成高層斜面。冷卻后呈桔紅色。如不立即使用，在2 ℃ ~8 ℃條件下可儲存一個(gè)月。
A.6 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑
A.6.1 成分
|
胰蛋白胨 |
20.0 g |
|
氯化鈉 |
5.0 g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH 7.4±0.2
A.6.2 制法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分裝小試管，121 ℃高壓滅菌 15 min。
注：此試劑在 2 ℃~8 ℃條件下可儲存一個(gè)月。
A.6.3 靛基質(zhì)試劑
A.6.3.1 柯凡克試劑：將 5 g 對二甲氨基苯甲醛溶解于 75 mL 戊醇中。然后緩慢加入濃鹽酸 25 mL。
A.6.3.2 歐－波試劑：將 1 g 對二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL 95%乙醇內。然后緩慢加入濃鹽酸 20 mL。
A.6.4 試驗方法
挑取少量培養物接種，在36 ℃±1 ℃培養1 d～2 d，必要時(shí)可培養4 d～5 d。加入柯凡克試劑約0.5 mL，輕搖試管，陽(yáng)性者于試劑層呈深紅色；或加入歐－波試劑約 0.5 mL，沿管壁流下，覆蓋于培養液表面，陽(yáng)性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。
A.7 半固體瓊脂
A.7.1 成分
|
蛋白胨 |
1.0 g |
|
牛肉膏 |
0.3 g |
|
氯化鈉 |
0.5 g |
|
瓊脂 |
0.3g～0.5g |
|
蒸餾水 |
100.0mL |
pH 7.4±0.2
A.7.2 制法
按以上成分配好，加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至 7.4 ± 0.2，分裝小試管。121 ℃滅菌 15 min，直立凝固備用。
A.8 尿素瓊脂（pH 7.2）
A.8.1 成分
|
蛋白胨 |
1.0 g |
|
氯化鈉 |
5.0 g |
|
葡萄糖 |
1.0 g |
|
磷酸二氫鉀 |
2.0 g |
|
0.4％酚紅 |
3.0 mL |
|
瓊脂 |
20.0 g |
|
20%尿素溶液 |
100.0 mL |
|
蒸餾水 |
1 000 mL |
pH7.2±0.2
A.8.2 制法
除酚紅和尿素外的其他成分加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.2±0.2，加入酚紅指示劑，混勻，于121 ℃滅菌15 min。冷至約55 ℃，加入用0.22 µm過(guò)濾膜除菌后的20%尿素水溶液100 mL，混勻，以無(wú)菌操作分裝滅菌試管，每管約3 mL～4 mL，制成斜面后放冰箱備用。
A.8.3 試驗方法
挑取瓊脂培養物接種，在 36 ℃±1 ℃培養 24 h，觀(guān)察結果。尿素酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿而使培養基變?yōu)榧t色。
A.9 氰化鉀（KCN）培養基
A.9.1 成分
|
蛋白胨 |
10.0 g |
|
氯化鈉 |
5.0 g |
|
磷酸二氫鉀 |
0.225 g |
|
磷酸氫二鈉 |
5.64 g |
|
0.5％氰化鉀 |
20.0 mL |
|
蒸餾水 |
1 000 mL |
A.9.2 制法
將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，分裝后 121 ℃高壓滅菌 15 min。放在冰箱內使其充分冷卻。每 100 mL 培養基加入 0.5％氰化鉀溶液 2.0 mL（最后濃度為 1:10 000），分裝于無(wú)菌試管內,每管約 4 mL,立刻用無(wú)菌橡皮塞塞緊,放在 4 ℃冰箱內,至少可保存兩個(gè)月。同時(shí)，將不加氰化鉀的培養基作為對照培養基,分裝試管備用。
A.9.3 試驗方法
將瓊脂培養物接種于蛋白胨水內成為稀釋菌液，挑取 1 環(huán)接種于氰化鉀（KCN）培養基。并另挑取 1 環(huán)接種于對照培養基。在 36 ℃±1 ℃培養 1 d～2 d，觀(guān)察結果。如有細菌生長(cháng)即為陽(yáng)性（不抑制），經(jīng) 2 d 細菌不生長(cháng)為陰性（抑制）。
注:氰化鉀是劇毒藥,使用時(shí)應小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養基應在冰箱內進(jìn)行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴,氰化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長(cháng)，因而造成假陽(yáng)性反應。試驗時(shí)對每一環(huán)節都要特別注意。
A.10 氧化酶試劑
A.10.1 成分
|
N,N’-二甲基對苯二胺鹽酸鹽或 N,N,N’,N’-四甲基對苯二胺鹽酸鹽 |
1.0 g |
|
蒸餾水 |
100mL |
A.10.2 制法
少量新鮮配制，于冰箱內避光保存，在7d內使用。
A.10.3 試驗方法
用無(wú)菌棉拭子取單個(gè)菌落，滴加氧化酶試劑，10s內呈現粉紅或紫紅色即為氧化酶試驗陽(yáng)性，不變色者為氧化酶試驗陰性。
A.11 革蘭氏染色液
A.11.1結晶紫染色液
A.11.1.1成分
|
結晶紫 |
1.0ｇ |
|
95％乙醇 |
20.0 mL |
|
1％草酸銨水溶液 |
80.0 mL |
A.111.2 制法
將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
A.11.2革蘭氏碘液
A.11.2.1成分
|
碘 |
1.0ｇ |
|
碘化鉀 |
2.0ｇ |
|
蒸餾水 |
300 mL |
A.11.2.2 制法
將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。
A.11.3 沙黃復染液
A.7.3.1 成分
|
沙黃 |
0.25ｇ |
|
95％乙醇 |
10mL |
|
蒸餾水 |
90mL |
A.11.3.2制法
將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。
A.11.4 染色法
A.11.4.1 涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染1min，水洗。
A.11.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。
A.11.4.3 滴加95％乙醇脫色約15s～30s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗。
A.11.4.4 滴加復染液，復染1min，水洗、待干、鏡檢。
A.12 BHI肉湯
A.12.1 成分
|
小牛腦浸液 |
200ｇ |
|
牛心浸液 |
250ｇ |
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蛋白胨 |
10.0ｇ |
|
NaCl |
5.0ｇ |
|
葡萄糖 |
2.0ｇ |
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磷酸氫二鈉（Na2HPO4） |
2.5ｇ |
|
蒸餾水 |
1 000 mL |
pH 7.4±0.2
A.12.2 制法
按以上成分配好，加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至 7.4±0.2，分裝小試管。121 ℃滅菌 15 min。
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