微生物的誘變育種

一、實(shí)驗目的和內容
目的：以紫外線(xiàn)誘變獲得用于醬油生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌株為例，學(xué)習微生物誘變育種的基本操作方法。
內容：1．對米曲霉(Aspergills oryzae )出發(fā)菌株進(jìn)行處理，制備孢子懸液。
     2．用紫外線(xiàn)進(jìn)行誘變處理。
     3．用平板透明圈法進(jìn)行兩次初篩。
     4．用搖瓶法進(jìn)行復篩及酶活性測定。
二、實(shí)驗材料和用具
米曲霉斜面菌種；
豆餅斜面培養基、酪素培養基、蒸餾水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、試管、培養皿(9cm)、恒溫搖床、恒溫培養箱、紫外照射箱、磁力攪拌器、脫脂棉、無(wú)菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精燈。
三、操作步驟
(一)出發(fā)菌株的選擇及菌懸液制備
1．出發(fā)菌株的選擇   可直接選用生產(chǎn)醬油的米曲霉菌株，或選用高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌懸液制備   取出發(fā)菌株轉接至豆餅斜面培養基中，30℃培養3～5d活化。然后孢子洗至裝有1mL 0.lmol/L pH6.0的無(wú)菌磷酸緩沖液的三角瓶中(內裝玻璃珠，裝量以大致鋪滿(mǎn)瓶底為宜)，30℃振蕩30min，用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過(guò)濾，制成把子懸液，調其濃度為106～108個(gè)/mL，冷凍保藏備用。
(二)誘變處理
用物理方法或化學(xué)方法，所用誘變劑種類(lèi)及劑量的選擇可視具體情況決定，有時(shí)還可采用復合處理，可獲得更好的結果。本實(shí)驗學(xué)習用紫外線(xiàn)照射的誘變方法。
1．紫外線(xiàn)處理   打開(kāi)紫外燈(30W)預熱20min。取5mL菌懸液放在無(wú)菌的培養皿(9cm)中，同時(shí)制作5份。逐一操作，將培養皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上，照射l min后打開(kāi)培養皿蓋，開(kāi)始照射，與照射處理開(kāi)始的同時(shí)打開(kāi)磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，即時(shí)計算時(shí)間，照射時(shí)間分別為15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，誘變菌液在黑暗冷凍中保存1～2h然后在紅燈下稀釋涂菌進(jìn)行初篩。
2．稀釋菌懸液   按10倍稀釋至10-6，從10-5和10-6中各取出0.lmL加入到酪素培養基平板中(每個(gè)稀釋度均做3個(gè)重復)，然后涂菌并靜置，待菌液滲入培養基后倒置，于30℃恒溫培養2～3d。
(三)優(yōu)良菌株的篩選
1. 初篩   首先觀(guān)察在菌落周?chē)�出現的透明圈大小，并測量其菌落直徑與透明圈直徑之比，選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落40～50個(gè)，作為復篩菌株。
2．平板復篩   分別倒酪素培養基平板，在每個(gè)平皿的背面用紅筆劃線(xiàn)分區，從圓心劃線(xiàn)至周邊分成8等份，1～7份中點(diǎn)種初篩菌株，第8份點(diǎn)種原始菌株，作為對照。培養48h后即可見(jiàn)生長(cháng)，若出現明顯的透明圈，即可按初篩方法檢測，獲得數株二次優(yōu)良菌株，進(jìn)大搖瓶復篩階段。
3．搖瓶復篩 將初篩出的菌株，接入米曲霉復篩培養基中進(jìn)行培養，其方法是，稱(chēng)取麥秩85g，豆餅粉(或面粉)15g，加水95～110mL(稱(chēng)為潤水)，水含量以手捏后指縫有水而不下滴為宜，于500mL三角瓶中裝入15～20g(料厚為1～1.5cm)，121℃濕熱滅菌30min，然后分別接入以上初篩獲得的優(yōu)良菌株，30℃培養，24h后搖瓶一次并均勻鋪開(kāi)，再培養24～48h，共培養3～5d后檢測蛋白酶活性。
4．蛋白酶的測定方法
(1)取樣：培養后隨機稱(chēng)取以上搖瓶培養物1g，加蒸餾水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液測定酶活性。另取lg培養物于105℃烘干測定含水量。
(2)酶活性測定：30℃ pH7.5條件下水解酪蛋白(底物為0.5%酪蛋白)，每分鐘產(chǎn)酪氨酸1μg為一個(gè)酶活力單位。計算公式為：
(A樣品OD680nm值-A對照OD680nm值)×K×V/t×N
K：標準曲線(xiàn)中光吸收為“1”時(shí)的酪氨酸微克數；
V：酶促反應的總體積；
t： 酶促反應時(shí)間(min)；
N：酶的稀釋倍數。
5．谷氨酸的檢測   此項檢測也是醬油優(yōu)良菌株的重要指標之一。
檢測培養基：豆餅粉：麩夫=6：4，潤水75%，121℃濕熱滅菌30min。
谷氨酸測定：于以上培養基中加入7%鹽水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d后過(guò)濾，以濾液檢測谷氨酸含量(測壓法)。
四、注意事項
1. 紫外線(xiàn)照射時(shí)注意保護眼睛和皮膚。
2. 誘變過(guò)程及誘變后的稀釋操作均在紅燈下進(jìn)行，并在黑暗中培養。
五、實(shí)驗報告
1. 試列表說(shuō)明高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選過(guò)程和結果。
2. 你認為以上的篩選方法有什么優(yōu)缺點(diǎn)，如何改進(jìn)？
六、問(wèn)題和思考
1．試述紫外線(xiàn)誘變的作用機理及其在具體操作中應注意的問(wèn)題。
2．為什么在誘變前要把菌懸液打散和培養一段時(shí)間？
注：篩選菌株數的計算  若按突變率為0.01計算，則一次篩選可取250—300個(gè)菌落，第一次篩選后可多選幾株高產(chǎn)株，而二級篩選為重點(diǎn)階段，其最適量可參考以下計算方法：如初篩菌株數為200株，二次篩選欲選株數為2株，則二級應選(200×2)1/2，為20株，這樣的數量選擇，使有可能從較少的數量中獲得相對較多的優(yōu)良菌株。
   
   

 

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