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1 范圍
本標準規定了食品中大腸菌群（ Coliforms）計數的方法。
本標準適用于食品中大腸菌群的計數。
2 術(shù)語(yǔ)和定義
2.1 大腸菌群 coliforms
在一定培養條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。
2.2 最可能數 most probable number，MPN
基于泊松分布的一種間接計數方法。
3 檢驗原理
3.1 MPN法
MPN法是統計學(xué)和微生物學(xué)結合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養后，根據其未生長(cháng)的最低稀釋度與生長(cháng)的最高稀釋度，應用統計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。
3.2 平板計數法
大腸菌群在固體培養基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。
4 設備和材料
除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
4.1 恒溫培養箱： 36 ℃ ±1 ℃。
4.2 冰箱： 2 ℃～5 ℃ 。
4.3 恒溫水浴箱： 46℃±1℃ 。
4.4 天平：感量 0.1 g。
4.5 均質(zhì)器。
4.6 振蕩器。
4.7 無(wú)菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
4.8 無(wú)菌錐形瓶：容量 500 mL。
4.9 無(wú)菌培養皿：直徑 90 mm。
4.10 pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙。
4.11 菌落計數器。
5 培養基和試劑
5.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（ Lauryl Sulfate Tryptose， LST）肉湯：見(jiàn)附錄 A 中 A.1。
5.2 煌綠乳糖膽鹽（ Brilliant Green Lactose Bile， BGLB）肉湯：見(jiàn)附錄 A 中 A.2。
5.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ Violet Red Bile Agar， VRBA）：見(jiàn)附錄 A 中 A.3。
5.4 磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)附錄 A 中 A.4。
5.5 無(wú)菌生理鹽水：見(jiàn)附錄 A 中 A.5。
5.6 無(wú)菌 1 mol/L NaOH：見(jiàn)附錄 A 中 A.6。
5.7 無(wú)菌 1 mol/L HCl：見(jiàn)附錄 A 中 A.7。
第一法 大腸菌群 MPN 計數法
6 檢驗程序
大腸菌群MPN計數的檢驗程序見(jiàn)圖1 。
圖1 大腸菌群 MPN 計數法檢驗程序
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 固體和半固體樣品：稱(chēng)取 25 g 樣品,放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內 ,8000 r/min～10000 r/min 均質(zhì) 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器以6次/s～9次/s拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的樣品勻液。
7.1.2 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jì)阮A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠）中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。
7.1.3 樣品勻液的 pH 值應在 6.5～7.5 之間，必要時(shí)分別用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 調節。
7.1.4 用 1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩緩注入 9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支 1 mL 無(wú)菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。
7.1.5 根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用 1 支1 mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15 min。
7.2 初發(fā)酵試驗
每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3
管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（ LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1 mL，則用雙料LST肉湯）， 36℃ ±1 ℃培養24 h±2 h，觀(guān)察倒管內是否有氣泡產(chǎn)生， 24 h±2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復發(fā)酵試驗（證實(shí)試驗），如未產(chǎn)氣則繼續培養至48 h±2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。
7.3 復發(fā)酵試驗（證實(shí)試驗）
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養物1 環(huán)， 移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（ BGLB） 管中， 36 ℃ ±1℃培養48 h±2 h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽(yáng)性管。
7.4大腸菌群最可能數（MPN）的報告
按7.3確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數，檢索MPN表（見(jiàn)附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的
MPN值。
第二法 大腸菌群平板計數法
8 檢驗程序
大腸菌群平板計數法的檢驗程序見(jiàn)圖2。
圖2 大腸菌群平板計數法檢驗程序
9 操作步驟
9.1 樣品的稀釋
按7.1進(jìn)行。
9.2 平板計數
9.2.1 選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續稀釋度, 每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1 mL。同時(shí)取1 mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對照。
9.2.2 及時(shí)將15 mL～20 mL冷至46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36 ℃ ±1 ℃培養18 h～24 h。
8.3 平板菌落數的選擇
選取菌落數在 15 CFU～150 CFU 之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落（如菌落直徑較典型菌落�。�。典型菌落為紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為 0.5 mm 或更大。
9.4 證實(shí)試驗
從 VRBA 平板上挑取 10 個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落，分別移種于 BGLB 肉湯管內， 36 ℃ ±1 ℃培養 24 h～48 h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡 BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽(yáng)性。
9.5 大腸菌群平板計數的報告
經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以9.3中計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g
（ mL）樣品中大腸菌群數。例： 10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數為： 100×6/10×104/g（ mL）=6.0×105CFU/g（ mL）。
附 錄A
培養基和試劑
A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化鈉 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g
磷酸二氫鉀（ KH2PO4） 2.75 g
月桂基硫酸鈉 0.1 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中，調節 pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管 10 mL。 121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯
A.2.1 成分
蛋白胨 10.0 g
乳糖 10.0 g
牛膽粉（ oxgall或oxbile）溶液 200 mL
0.1%煌綠水溶液 13.3 mL
蒸餾水 800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中，調節pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調節pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補足到1 000 mL，用棉花過(guò)濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
A.3.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化鈉 5.0 g
膽鹽或3號膽鹽 1.5 g
中性紅 0.03 g
結晶紫 0.002 g
瓊脂 15 g～18 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.4±0.1
A.3.2 制法
將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調節pH。煮沸2 min，將培養基冷卻至45 ℃～
50 ℃傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過(guò)3 h。
A.4 磷酸鹽緩沖液
A.4.1 成分
磷酸二氫鉀（ KH2PO4） 34.0 g
蒸餾水 500 mL
pH 7.2
A.4.2 制法
貯存液：稱(chēng)取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中， 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.5 無(wú)菌生理鹽水
A.5.1 成分
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1000 mL
A.5.2 制法
稱(chēng)取8.5ｇ氯化鈉溶于1000 mL蒸餾水中， 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.6 1 mol/L NaOH
A.6.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸餾水 1000 mL
A.6.2 制法
稱(chēng)取40 g氫氧化鈉溶于1000 mL蒸餾水中， 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.7 1 mol/L HCl
A.7.1 成分
HCl 90 mL
蒸餾水 1000 mL
A.7.2 制法
移取濃鹽酸90 mL，用蒸餾水稀釋至1000 mL， 121 ℃高壓滅菌15 min。
附 錄B
大腸菌群最可能數（MPN）檢索表
B.1大腸菌群最可能數（MPN）檢索表
每g（mL）檢樣中大腸菌群最可能數（MPN）的檢索見(jiàn)表B.1。
表B.1 大腸菌群最可能數（MPN）檢索表
|
陽(yáng)性管數 |
MPN |
95%可信限 |
陽(yáng)性管數 |
MPN |
95%可信限 |
||||||
|
0.10 |
0.01 |
0.001 |
下限 |
上線(xiàn) |
0.10 |
0.01 |
0.001 |
下限 |
上限 |
||
|
0 |
0 |
0 |
＜3.0 |
－－ |
9.5 |
2 |
2 |
0 |
21 |
4.5 |
42 |
|
0 |
0 |
1 |
3.0 |
0.15 |
9.6 |
2 |
2 |
1 |
28 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
0 |
3.0 |
0.15 |
11 |
2 |
2 |
2 |
35 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
1 |
6.1 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
0 |
29 |
8.7 |
94 |
|
0 |
2 |
0 |
6.2 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
1 |
36 |
8.7 |
94 |
|
0 |
3 |
0 |
9.4 |
3.6 |
38 |
3 |
0 |
0 |
23 |
4.6 |
94 |
|
1 |
0 |
0 |
3.6 |
0.17 |
18 |
3 |
0 |
1 |
38 |
8.7 |
110 |
|
1 |
0 |
1 |
7.2 |
1.3 |
18 |
3 |
0 |
2 |
64 |
17 |
180 |
|
1 |
0 |
2 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
0 |
43 |
9 |
180 |
|
1 |
1 |
0 |
7.4 |
1.3 |
20 |
3 |
1 |
1 |
75 |
17 |
200 |
|
1 |
1 |
1 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
2 |
120 |
37 |
420 |
|
1 |
2 |
0 |
11 |
3.6 |
42 |
3 |
1 |
3 |
160 |
40 |
420 |
|
1 |
2 |
1 |
15 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
0 |
93 |
18 |
420 |
|
1 |
3 |
0 |
16 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
1 |
150 |
37 |
420 |
|
2 |
0 |
0 |
9.2 |
1.4 |
38 |
3 |
2 |
2 |
210 |
40 |
430 |
|
2 |
0 |
1 |
14 |
3.6 |
42 |
3 |
2 |
3 |
290 |
90 |
1000 |
|
2 |
0 |
2 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
0 |
240 |
42 |
1000 |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
3.7 |
42 |
3 |
3 |
1 |
460 |
90 |
2000 |
|
2 |
1 |
1 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
180 |
4100 |
|
2 |
1 |
2 |
27 |
8.7 |
94 |
3 |
3 |
3 |
＞1100 |
420 |
－－ |
|
注1：本表采用3個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)]，每個(gè)稀釋度接種3管。 注2：表內所列檢樣量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內數字應相應降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.00001g(mL)時(shí)，則表內數字應相應增高10倍，其余類(lèi)推。 |
|||||||||||
